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【摘 要】 目的：建立不同采收期珠子参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa、姜状三七苷R1以及去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa 5种化学成分的含量测定方法。方法：采用Thermo C18 （5μm，4.6 mm×250 mm） 色谱柱;以0.02%的磷酸水溶液和乙腈进行梯度洗脱;柱温 30 ℃;流速1 mL·min-1;检测波长 203 nm。结果：不同采收期中5种化学成分含量积累在7月份达到最高。结论：7月份可作为珠子参最佳采收期，用于珠子参的质量控制。
【关键词】 珠子参;高效液相色谱法;皂苷类成分;不同采收期
【中图分类号】R282 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2021）12-0042-05
Abstract：Objective To establish a method for the determination of ginsenoside Rg1，ginsenoside Ro，chikusetsusaponin IVa，zingibroside R1 and deglucose chikusetsusaponin Ⅳ a in Panacis Majoris Rhizoma at different harvesting stages. Methods A Thermo C18 （5 μm，4.6 mm×250 mm） chromatographic column with gradient elution using 0.02% phosphoric acid aqueous solution and acetonitrile at 30 ℃ at a flow rate of 1 mL·min-1 and detection wavelength of 203 nm.Results The accumulation of the five chemical components in the different harvesting periods was highest in July.Conclusion The month of July can be used as the best harvesting period for quality control of Panacis Majoris Rhizoma.
Keywords：Panacis Majoris Rhizoma; High Performance Liquid Chromatography; Active Ingredient;Harvesting Time
珠子參Panacis Majoris Rhizoma（PMR）为五加科人参属珠子参Panax japonicus C.A.Meg var.major （Burk.） C.Y.Wu et Feng ex C.Chow的干燥根茎，又名扣子七、珠儿参，主产于陕西、四川、云南、甘肃、宁夏、西藏等地，味苦、甘，性微寒，有滋阴养肺、止血活络、益气强身等功效[1]。珠子参根茎是主要的药用部位，主要包含皂苷、多糖、黄酮、微量元素等，目前已经从珠子参不同部位分离获得多个单体皂苷，珠子参总皂苷具有一定的镇痛抗炎[2]、增强免疫[3]、抗肿瘤[4-7]等活性。珠子参生长缓慢成药周期长，多生长于荫蔽的林下等地，目前野生珠子参已处于极度濒危状态，对珠子参的研究也多为化学成分、药理活性等，而栽培、资源分布等较少，因此合理规划其采收期是极其重要的。本实验采用高效液相色谱法对5～7月不同采收期珠子参中5种化学成分含量变化，来确定珠子参最佳采收期。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Waters 2695 高效液相色谱仪; GB204 型电子分析天平 （北京赛多利斯）; KQ-200KED 超声波清洗机 （江苏昆山）; GZX- 9140MBE电热鼓风干燥箱 （上海博迅）。
1.2 试药 供试材料来源于陕西太白山种植基地，由陕西中医药大学王继涛高级实验师鉴定为五加科植物珠子参Panax japonicus C.A.Meg var.major （Burk.） C.Y.Wu et Feng。人参皂苷Ro（批号 111903-201805）和人参皂苷Rg1（批号110703-201933）均购于中国食品药品检定研究院，姜状三七皂苷Rg1（批号B50413），竹节参Ⅳa（批号B21676），去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa（批号B24067）均购于上海源叶公司。
1.人参皂苷Rg1;2.人参皂苷Ro;3.竹节参皂苷Ⅳa;4.姜状三七皂苷R1;5.去葡萄糖竹节参Ⅳa
2 方法与结果
2.1 供试品溶液制备 珠子参根茎烘干，称重，粉碎，取0.1 g，精密称定，置于50 mL锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，称重。超声处理40 min（功率500 W，频率40kHz），放至室温，补足失量，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，待测。
2.2 混合对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，分别置于10 mL棕色容量瓶中，用适量色谱甲醇溶液溶解并稀释至刻度，分别制成含人参皂苷Rg1 0.04 mg·mL-1、人参皂苷Ro 0.2 mg·mL-1、竹节参皂苷Ⅳa 0.25 mg·mL-1、姜状三七皂苷R1 0.1 mg·mL-1、去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa 0.1 mg·mL-1的对照品储备液，0.22 μm微孔滤膜滤过即得。
2.3 色谱条件 色谱柱为Thermo C18 （5 μm，4.6 mm × 250 mm） 色谱柱;流动相为乙腈（A）-0.02%磷酸水（B），梯度洗脱（0～10 min： 5%～40%A; 10～22 min： 40%～75%A，22～34 min： 75%～90%A），检测波长203 nm，柱温30℃，体积流量1.0 mL·min-1，进样量为10 μL。 2.4 线性关系考察 精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液1、5、10、 15、20 μL，按“2.3”项下色谱条件测定峰面积，以进样量为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），进行线性回归，得回归方程，见表1。
2.5 精密度实验 精密吸取混合对照品溶液 10 μL，重复进样 5 次，测定峰面积，计算得人参皂苷Rg1、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa、姜状三七皂苷R1、去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa的RSD分别为1.3%、2.1%、2.5%、2.4%、1.1%。
2.6 重复性实验 精密称取同一批样品（采收时间2019年6月1日）6份，按“2.1”项下方法制备，吸取10 μL 进样，测定峰面积，计算得人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa、姜状三七苷R1、去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa的RSD分别为2.4%、1.2%、2.3%、1.5%、2.1%，符合要求。
2.7 稳定性实验 取供试品溶液（采收时间2019年6月1日），分别于配制后0、3、6、9、12、24 h 进样10 μL，测定峰面积，计算得人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa、姜状三七苷R1、去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa的RSD分别为1.2%、2.3%、2.1%、1.6%、1.5%。 結果表明，供试品溶液在 24 h 内稳定性良好。
2.8 加样回收实验 精密称取同一批样品（采收时间2019年6月1日）珠子参药材0.1g，平行称定6份。分别精密加入人参皂苷Rg1、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa、姜状三七苷R1、去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa对照品适量，按2.1项下方法制备成供试品溶液在上述色谱条件下测定，计算得到各成分平均加样回收率为97.3～99.3%，RSD为1.8～2.5%，表明方法准确度较好，结果见表2。
2.9 不同采样时间中5中化学成分的含量测定 精密称取不同批次样品珠子参药材粗粉0.1 g，每组重复6 次，按“2.1”项下方法制备供试品，按“2.3”项 下条件进样分析，测定峰面积，计算含量，结果见表 3。5种成分从5月份开始含量积累逐步增加，直至7月份达到最大，随后开始下降，其中人参皂苷Ro与竹节参皂苷Ⅳa最为显著。
3 讨论
中药材有效成分含量对其质量至关重要，直接影响药材药理活性[8]。靳维荣等[9]发现黄芩在9月份黄酮类含量最高，李雪营等[10]发现不同采收期对黔产鸭跖草若也有显著影响，研究表明7、8月采收最为适宜。
珠子参作为秦巴山区特色药材之一，具有多种化学成分，不同时期的珠子参成分含量相差甚远。本实验首次建立HPLC法同时测定珠子参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa、姜状三七皂苷R1和去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa 5种皂苷类成分含量的方法，结果显示，5种皂苷类成分含量在不同时期的含量都存在明显差异，随着不同时期的采收可以看出5种皂苷类成分含量有明显差异，5种皂苷类成分含量都在逐步增高，其中人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa含量始终最高，7月份采收含量显著高于其它月份采收样品，说明珠子参适合夏末秋初采收，李渊源等[11]研究亦证实了这一点，本实验结果与《陕西中草药》[12]、15版《中国药典》[1]中记载的珠子参采收期为“夏秋采挖”“秋季采收”有共同相似之处，为进一步证明传统采收时间的合理性提供了科学依据，但具体时间还需根据气候条件等考虑。本实验只选取了5～8月份，且5种成分在7个时间点含量差距较大，分析原因可能是珠子参地上部分正在萌发从而导致根茎中的代谢产物质量减小，此外除不同采收时间对含量有所影响，如土壤温度、空气温度、湿度、光合有效辐射等生态因素的不同有效成分也会发生不同程度的变化[13-14]，气候对珠子参有效成分积累有待进一步研究。
综上所述，经方法学考察，本研究所建立的HPLC法线性关系、精密度、重复性和稳定性均良好，可用于同时测定不同采收期珠子参药材中5种有效成分的含量。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：271-272.
[2]姜祎，考玉萍，宋小妹.珠子参叶总皂苷抗炎镇痛作用的实验研究[J].陕西中医，2008，29（6）：732-733.
[3]段径云，陈瑞明.珠子参对血液和造血功能的影响[J].西北药学杂志，1996，11（2）：72-73.
[4]宋蓓，徐悦，李玉泽，等.“太白七药”珠子参化学成分及抗肿瘤活性研究[J].中南药学，2019，17（8）：1210-1214.
[5]王炳淑，梁荣珍，戢楠楠.珠子参多糖通过靶向let-7a/CDK6分子轴调控胃癌MKN45细胞的增殖与凋亡[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2020，27（2）：135-141.
[6]史鑫波，唐志书，雷莉妍，等.珠子参提取物抗氧化活性及其对乳腺癌细胞的抑制作用研究[J].中南药学，2019，17（12）：2073-2076.
[7]杨庆晓，姚姝妍，宋彬，等.珠子参汤剂对脑胶质瘤U87细胞增殖、凋亡的影响及其机制研究[J].中国煤炭工业医学杂志，2019，22（5）：523-527.
[8]王存琴，汪雷，陈颖，等.高效液相色谱法同时测定不同采收期枸骨叶中4种三萜类成分含量[J].中药新药与临床药理，2020，31（9）：1092-1096.
[9]靳维荣，石俊英，张小伟.不同采收期黄芩中六种黄酮类成分的动态研究[J].山东中医杂志，2008（4）：268-271.
[10]李雪营，梁黔生，林先燕，等.不同采收期黔产鸭跖草中异荭草素含量及生物产量的动态变化[J].亚太传统医药，2020，16（9）：75-76.
[11]李渊源，王青，王薇，等.不同采收期珠子参中竹节参皂苷Ⅳa含量测定[J].陕西中医学院学报，2012，35（3）：74-76.
[12]陕西革命委员会卫生局，商业局.陕西中草药[M].北京：科学出版社，1971：590.
[13]张甜，程林，杨林林，等.生态因子及关键酶基因表达对秋季黄芩采收期主要药效成分合成的影响[J].中草药，2019，50（4）：936-944.
[14]黄林芳，李文涛，王珍，等.濒危高原植物羌活化学成分与生态因子的相关性[J].生态学报，2013，33（24）：7667-7678.
（收稿日期：2020-11-16 编辑：程鹏飞）
【关键词】 珠子参;高效液相色谱法;皂苷类成分;不同采收期
【中图分类号】R282 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2021）12-0042-05
Abstract：Objective To establish a method for the determination of ginsenoside Rg1，ginsenoside Ro，chikusetsusaponin IVa，zingibroside R1 and deglucose chikusetsusaponin Ⅳ a in Panacis Majoris Rhizoma at different harvesting stages. Methods A Thermo C18 （5 μm，4.6 mm×250 mm） chromatographic column with gradient elution using 0.02% phosphoric acid aqueous solution and acetonitrile at 30 ℃ at a flow rate of 1 mL·min-1 and detection wavelength of 203 nm.Results The accumulation of the five chemical components in the different harvesting periods was highest in July.Conclusion The month of July can be used as the best harvesting period for quality control of Panacis Majoris Rhizoma.
Keywords：Panacis Majoris Rhizoma; High Performance Liquid Chromatography; Active Ingredient;Harvesting Time
珠子參Panacis Majoris Rhizoma（PMR）为五加科人参属珠子参Panax japonicus C.A.Meg var.major （Burk.） C.Y.Wu et Feng ex C.Chow的干燥根茎，又名扣子七、珠儿参，主产于陕西、四川、云南、甘肃、宁夏、西藏等地，味苦、甘，性微寒，有滋阴养肺、止血活络、益气强身等功效[1]。珠子参根茎是主要的药用部位，主要包含皂苷、多糖、黄酮、微量元素等，目前已经从珠子参不同部位分离获得多个单体皂苷，珠子参总皂苷具有一定的镇痛抗炎[2]、增强免疫[3]、抗肿瘤[4-7]等活性。珠子参生长缓慢成药周期长，多生长于荫蔽的林下等地，目前野生珠子参已处于极度濒危状态，对珠子参的研究也多为化学成分、药理活性等，而栽培、资源分布等较少，因此合理规划其采收期是极其重要的。本实验采用高效液相色谱法对5～7月不同采收期珠子参中5种化学成分含量变化，来确定珠子参最佳采收期。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Waters 2695 高效液相色谱仪; GB204 型电子分析天平 （北京赛多利斯）; KQ-200KED 超声波清洗机 （江苏昆山）; GZX- 9140MBE电热鼓风干燥箱 （上海博迅）。
1.2 试药 供试材料来源于陕西太白山种植基地，由陕西中医药大学王继涛高级实验师鉴定为五加科植物珠子参Panax japonicus C.A.Meg var.major （Burk.） C.Y.Wu et Feng。人参皂苷Ro（批号 111903-201805）和人参皂苷Rg1（批号110703-201933）均购于中国食品药品检定研究院，姜状三七皂苷Rg1（批号B50413），竹节参Ⅳa（批号B21676），去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa（批号B24067）均购于上海源叶公司。
1.人参皂苷Rg1;2.人参皂苷Ro;3.竹节参皂苷Ⅳa;4.姜状三七皂苷R1;5.去葡萄糖竹节参Ⅳa
2 方法与结果
2.1 供试品溶液制备 珠子参根茎烘干，称重，粉碎，取0.1 g，精密称定，置于50 mL锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，称重。超声处理40 min（功率500 W，频率40kHz），放至室温，补足失量，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，待测。
2.2 混合对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，分别置于10 mL棕色容量瓶中，用适量色谱甲醇溶液溶解并稀释至刻度，分别制成含人参皂苷Rg1 0.04 mg·mL-1、人参皂苷Ro 0.2 mg·mL-1、竹节参皂苷Ⅳa 0.25 mg·mL-1、姜状三七皂苷R1 0.1 mg·mL-1、去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa 0.1 mg·mL-1的对照品储备液，0.22 μm微孔滤膜滤过即得。
2.3 色谱条件 色谱柱为Thermo C18 （5 μm，4.6 mm × 250 mm） 色谱柱;流动相为乙腈（A）-0.02%磷酸水（B），梯度洗脱（0～10 min： 5%～40%A; 10～22 min： 40%～75%A，22～34 min： 75%～90%A），检测波长203 nm，柱温30℃，体积流量1.0 mL·min-1，进样量为10 μL。 2.4 线性关系考察 精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液1、5、10、 15、20 μL，按“2.3”项下色谱条件测定峰面积，以进样量为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），进行线性回归，得回归方程，见表1。
2.5 精密度实验 精密吸取混合对照品溶液 10 μL，重复进样 5 次，测定峰面积，计算得人参皂苷Rg1、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa、姜状三七皂苷R1、去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa的RSD分别为1.3%、2.1%、2.5%、2.4%、1.1%。
2.6 重复性实验 精密称取同一批样品（采收时间2019年6月1日）6份，按“2.1”项下方法制备，吸取10 μL 进样，测定峰面积，计算得人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa、姜状三七苷R1、去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa的RSD分别为2.4%、1.2%、2.3%、1.5%、2.1%，符合要求。
2.7 稳定性实验 取供试品溶液（采收时间2019年6月1日），分别于配制后0、3、6、9、12、24 h 进样10 μL，测定峰面积，计算得人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa、姜状三七苷R1、去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa的RSD分别为1.2%、2.3%、2.1%、1.6%、1.5%。 結果表明，供试品溶液在 24 h 内稳定性良好。
2.8 加样回收实验 精密称取同一批样品（采收时间2019年6月1日）珠子参药材0.1g，平行称定6份。分别精密加入人参皂苷Rg1、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa、姜状三七苷R1、去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa对照品适量，按2.1项下方法制备成供试品溶液在上述色谱条件下测定，计算得到各成分平均加样回收率为97.3～99.3%，RSD为1.8～2.5%，表明方法准确度较好，结果见表2。
2.9 不同采样时间中5中化学成分的含量测定 精密称取不同批次样品珠子参药材粗粉0.1 g，每组重复6 次，按“2.1”项下方法制备供试品，按“2.3”项 下条件进样分析，测定峰面积，计算含量，结果见表 3。5种成分从5月份开始含量积累逐步增加，直至7月份达到最大，随后开始下降，其中人参皂苷Ro与竹节参皂苷Ⅳa最为显著。
3 讨论
中药材有效成分含量对其质量至关重要，直接影响药材药理活性[8]。靳维荣等[9]发现黄芩在9月份黄酮类含量最高，李雪营等[10]发现不同采收期对黔产鸭跖草若也有显著影响，研究表明7、8月采收最为适宜。
珠子参作为秦巴山区特色药材之一，具有多种化学成分，不同时期的珠子参成分含量相差甚远。本实验首次建立HPLC法同时测定珠子参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa、姜状三七皂苷R1和去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa 5种皂苷类成分含量的方法，结果显示，5种皂苷类成分含量在不同时期的含量都存在明显差异，随着不同时期的采收可以看出5种皂苷类成分含量有明显差异，5种皂苷类成分含量都在逐步增高，其中人参皂苷Ro、竹节参皂苷Ⅳa含量始终最高，7月份采收含量显著高于其它月份采收样品，说明珠子参适合夏末秋初采收，李渊源等[11]研究亦证实了这一点，本实验结果与《陕西中草药》[12]、15版《中国药典》[1]中记载的珠子参采收期为“夏秋采挖”“秋季采收”有共同相似之处，为进一步证明传统采收时间的合理性提供了科学依据，但具体时间还需根据气候条件等考虑。本实验只选取了5～8月份，且5种成分在7个时间点含量差距较大，分析原因可能是珠子参地上部分正在萌发从而导致根茎中的代谢产物质量减小，此外除不同采收时间对含量有所影响，如土壤温度、空气温度、湿度、光合有效辐射等生态因素的不同有效成分也会发生不同程度的变化[13-14]，气候对珠子参有效成分积累有待进一步研究。
综上所述，经方法学考察，本研究所建立的HPLC法线性关系、精密度、重复性和稳定性均良好，可用于同时测定不同采收期珠子参药材中5种有效成分的含量。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：271-272.
[2]姜祎，考玉萍，宋小妹.珠子参叶总皂苷抗炎镇痛作用的实验研究[J].陕西中医，2008，29（6）：732-733.
[3]段径云，陈瑞明.珠子参对血液和造血功能的影响[J].西北药学杂志，1996，11（2）：72-73.
[4]宋蓓，徐悦，李玉泽，等.“太白七药”珠子参化学成分及抗肿瘤活性研究[J].中南药学，2019，17（8）：1210-1214.
[5]王炳淑，梁荣珍，戢楠楠.珠子参多糖通过靶向let-7a/CDK6分子轴调控胃癌MKN45细胞的增殖与凋亡[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2020，27（2）：135-141.
[6]史鑫波，唐志书，雷莉妍，等.珠子参提取物抗氧化活性及其对乳腺癌细胞的抑制作用研究[J].中南药学，2019，17（12）：2073-2076.
[7]杨庆晓，姚姝妍，宋彬，等.珠子参汤剂对脑胶质瘤U87细胞增殖、凋亡的影响及其机制研究[J].中国煤炭工业医学杂志，2019，22（5）：523-527.
[8]王存琴，汪雷，陈颖，等.高效液相色谱法同时测定不同采收期枸骨叶中4种三萜类成分含量[J].中药新药与临床药理，2020，31（9）：1092-1096.
[9]靳维荣，石俊英，张小伟.不同采收期黄芩中六种黄酮类成分的动态研究[J].山东中医杂志，2008（4）：268-271.
[10]李雪营，梁黔生，林先燕，等.不同采收期黔产鸭跖草中异荭草素含量及生物产量的动态变化[J].亚太传统医药，2020，16（9）：75-76.
[11]李渊源，王青，王薇，等.不同采收期珠子参中竹节参皂苷Ⅳa含量测定[J].陕西中医学院学报，2012，35（3）：74-76.
[12]陕西革命委员会卫生局，商业局.陕西中草药[M].北京：科学出版社，1971：590.
[13]张甜，程林，杨林林，等.生态因子及关键酶基因表达对秋季黄芩采收期主要药效成分合成的影响[J].中草药，2019，50（4）：936-944.
[14]黄林芳，李文涛，王珍，等.濒危高原植物羌活化学成分与生态因子的相关性[J].生态学报，2013，33（24）：7667-7678.
（收稿日期：2020-11-16 编辑：程鹏飞）