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摘要：[目的]优化南重楼中4种重楼皂苷提取的最佳工艺。[方法]采用L9（34）正交试验，对提取溶剂的单次料液比、单次提取时间、初始提取温度、提取次数4因素进行优化考察，HPLC法测定4种重楼皂苷含量并作为考察指标。[结果]最佳提取工艺单次料液比为15倍的甲醇，每次提取20 min，初始提取温度为40 ℃，提取次数为3次。[结论]该提取工艺操作简单、合理、可行、重复性好、稳定可靠，可用于南重楼中4种重楼皂苷的提取。
关键词：南重楼；重楼皂苷；HPLC法；提取工艺；正交试验
中图分类号：S567.23+9 文献标识码：A 文章编号：0517-6611（2016）07-158-03
Abstract：[Objective] To select the optimal extraction procedure of polyphyllin from four kinds of Paris vietnamensis. [Method] L9（34） orthogonal test was adopted to investigate the four factors of solidliquid ratio， extraction time， initial extraction temperature and extraction times. Polyphyllin contents in four kinds of P. vietnamensis were detected by HPLC method. [Result] The optimal extraction condition was as follows： 15 times of methanol， 20 min extraction time， 40 ℃ extraction temperature， and three extraction times. [Conclusion] This extraction technology is simple， stable， reliable， reasonable and feasible， and can be used for the extraction of polyphyllin from four kinds of P. vietnamensis.
Key words：Paris vietnamensis； Polyphyllin； HPLC method； Extraction technology； Orthogonal design
南重楼Paris vietnamensis（Takht.）H.Li 为百合科重楼属植物，主要分布于贵州，广西西南部、西部，以及云南的东南部、南部和西部，越南北部也有少量分布[1-2]，其以根茎入药，具有清热解毒、散瘀消肿、祛痰、平喘和止血的功能[3]。查阅相关文献表明，重楼皂苷提取方法有超声提取法、微波提取法、酶解法、浸渍法和回流提取法等[4-6]，不同的方法具有各自的优点，超声提取具有方便、能明显缩短提取时间、降低提取温度等优点，因此在重楼提取工艺中应用较多。基于超声提取的这些优点，该试验采用正交试验对提取溶剂的单次料液比、单次提取时间、初始提取温度、提取次数4因素进行优化考察，HPLC法测定4种重楼皂苷含量并作为考察指标，对南重楼中4种重楼皂苷超声提取工艺进行优选，以获取最佳提取工艺。
1：材料与方法
1.1：材料
1.1.1：
仪器。Agilent 1290高效液相色谱仪（G4204A Quat
Pump，G4226A Sampler，G1316C TCC，G4212B DAD）；EL204
十万分之一电子天秤[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；SB25120型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；艾柯DZG303A超纯水机[（台湾艾柯）成都康宁实验专用纯水设备厂]。
1.1.2：
试药。重楼皂苷I、II、VI、VII对照品（贵州迪大生物科技有限责任公司，批号分别为GZDD0605、GZDD0606、GZDD0608、GZDD0609，纯度均达98%以上），流动相所用乙腈、甲醇均为HPLC级色谱纯。其余试剂为分析纯，水为超纯水。
1.1.3：
试材。样品于2014年9月18日采自云南省文山壮族苗族自治州，经大理大学药学与化学学院生药教研室夏从龙教授鉴定为南重楼（Paris vietnamensis）。
1.2：方法
1.2.1：
正交試验。选取甲醇单次料液比（A）、单次提取时间（B）、初始提取温度（C）、提取次数（D）为考察因素，以4种重楼皂苷含量为指标，采用L9（34）正交表（表1）安排试验。
1.2.2：
对照品溶液的制备。准确称取重楼皂苷I、II、VI、VII这4种对照品，溶于甲醇配制成质量浓度分别为0.64、0.46、0.26、0.23 mg/mL的对照品溶液，按1∶1∶1∶1混合，过滤，备用。
1.2.3：
正交试验供试品溶液的制备。根据L9（34）正交设计因素水平表，精密称定南重楼粉末（过40目筛）采用对应提取方式，得到不同提取条件下的提取溶液，过滤，备用。
1.2.4：方法学考察。
1.2.4.1：色谱条件及系统适用性。根据药典方法[7]进行适当的调整，色谱柱为AgilentC18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），检测波长为203 nm，柱温25 ℃；流动相乙腈（A）—水（B）梯度洗脱（0～14 min，30%～40%A；14～40 min，40%A；40～70 min，40%～60%A），流速为0.9 mL/min，进样量5 μL。 1.2.4.2：
标准曲线的绘制。分别精密吸取混合对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积。以进样量X（μg）为横坐标、峰面积Y为纵坐标进行线性回归。
1.2.4.3：
精密度试验。精密吸取对照品溶液连续进样5次，测定重楼皂苷I、II、VI、VII的峰面积，计算RSD值。
1.2.4.4：
稳定性考察。取供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样测定峰面积，计算重楼皂苷I、II、VI、VII峰面积的RSD值。
1.2.4.5：
重复性试验。取样品5份，按最优工艺制备供试品溶液，测定重楼皂苷I、II、VI、VII的含量并计算其RSD。
1.2.4.6：
加样回收率试验。精密称定样品5份，加入各对照品适量，按选定的最优工艺制备供试品溶液。按“1.2.4.1”色谱条件测定重楼皂苷I、II、VI、VII的含量并计算其RSD。
1.2.5：
样品含量测定。吸取供试品溶液和混合对照品溶液，按“1.2.4.1”色谱条件测定各色谱峰的峰面积，利用标准曲线法计算含量。
1.2.6：
验证试验。精密称定样品5份，以选定最优工艺提取，按“1.2.4.1 ”色谱条件测定重楼皂苷I、II、VI、VII的含量以考察最优工艺的稳定性。
2：结果与分析
2.1：方法学考察
2.1.1：
系统适用性。图1表明，在“1.2.4.1”条件下，样品所测主峰旁无明显杂质峰，经计算样品峰与其他峰的分离度>1.5，理论塔板数按重楼皂苷I、II、VI、VII计算均不低于10 000，符合含量测定要求。
2.1.2：
标准曲线的绘制。按“1.2.4.2”测定，以进样量X（μg）为横坐标、峰面积Y为纵坐标得出重楼皂苷I、II、VI、VII的线性回归方程分别为YI=366.44XI+3.07（r=0999 9）、YII=377.60XII+2.42（r=0.999 9）、YVI=34035XVI+1.63（r=0.999 9）、YVII=344.22XVII+0.37（r=0.999 9），表明重楼皂苷I、II、VI、VII分别在0.64～12.80、0.46～9.20、0.26～5.20、0.23～4.60 μg范围内线性关系良好。
2.1.3：
精密度试验。连续进样5次，重楼皂苷I、II、VI、VII峰面积的RSD分别为2.34%、2.06%、2.17%、2.10%，表明该方法精密度良好。
2.1.4：
稳定性考察。按“1.2.4.4”操作，重楼皂苷I、II、VI、VII峰面积的RSD分别为2.02%、2.71%、2.72%、2.98%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.1.5：
重复性试验。平行样5份，测定重楼皂苷I、II、VI、VII的含量，其含量的RSD分别为0.54%、2.15%、1.91%、278%，表明方法重复性良好。
2.1.6：
加样回收率试验。按“1.2.4.6”操作，测定重楼皂苷I、II、VI、VII的平均回收率分别为101.04%、101.73%、9869%、101.17%，RSD分别为1.33%、2.34%、1.64%、217%。
2.2：样品含量测定：
按L9（34）正交表进行试验，结果表明（表2），南重楼中重楼皂苷的最佳提取工艺为A3B2C2D3组合，即15倍的溶媒，每次提取20 min，初始提取温度为40 ℃，提取3次，极差R顺序为D>C>A>B，即所考察因素中提取次数对重楼皂苷的提取率影响最大，其次为初始提取温度、甲醇单次料液比、单次提取时间。
2.3：验证试验：
由表3可知，通过选定的最优工艺提取的样品，其总含量的平均值为13.349 mg/g，RSD=0.84%，表明该工艺达到了优化目的且稳定性良好。
3：讨论与结论
近年来已有很多研究通过正交试验来优化重楼皂苷的提取工艺[8-12]，卢伟等[9]采用正交试验优选出重楼甾体皂苷最佳提取工艺为90%的乙醇溶液加热回流提取，料液比为1∶12，提取3次，每次1 h；冯旋等[11]采用正交试验优选出提取重楼甾体皂苷的最佳工艺为4倍于生药量的70%乙醇回流提取3次，每次2 h；郭莉萍等[13]基于均匀设计优化出重楼皂苷提取的最佳工艺为加热回流时间20 min、浸泡时间29.02 h、提取液乙醇浓度39.68%、加热回流次数8次，但各提取工藝不尽相同，且总皂苷的含量也各不相同。而该试验综合以上试验全面地考察了南重楼中4种重楼皂苷的提取工艺，试验采用HPLC法测定4种重楼皂苷含量并作为考察指标，以L9（34）正交试验考察了超声提取4种重楼皂苷中不
同因素对提取率的影响，结果表明，对重楼皂苷提取率影响最大的因素为提取次数，其次为初始提取温度和甲醇单次料液比，影响最小的为单次提取时间；得出最佳工艺为甲醇单次料液比1∶15、每次提取20 min、初始提取温度为40 ℃、提取3次，最优
工艺验证试验结果表明该方法可行、重复性好、稳定可靠，可用于南重楼中4种重楼皂苷的提取，通过该试验进一步优化南重楼中4种重楼皂苷的提取工艺，为南重楼中4种重楼皂苷的提取提供理论依据。
参考文献
[1] 中国科学院中国植物志编委员会.中国植物志：第15卷[M].北京：科学出版社，1978：86.
[2] 中国科学院昆明植物研究所.云南植物志：第8卷（下）[M].北京：科学出版社，2006：664.
[3] 黄芸，崔力剑，王强，等.南重楼 Paris vietnamensis活性物质的分离与鉴定[J].药学学报，2006，41（4）：361-364.
[4] 兰洁，杨明，马家骅.重楼提取工艺的研究[J].中草药，2006，37（6）：871-872.
[5] 冯旋，黄文通，陈军.重楼皂苷提取工艺的研究[J].广东药学，2005，15（6）：19.
[6] 叶方，杨光义，李志荣，等.重楼皂苷的提取工艺及质量控制研究概述[J].中国药师，2011，14（8）：1207-1209.
[7] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：260.
[8] 李维莉，彭永芳，李银，等.超声法提取重楼中重楼皂苷的研究[J].中成药，2010，32（2）：218-220.
[9] 卢伟，杨光义，叶方，等.正交试验设计优选重楼总皂苷提取工艺[J].中国药师，2015，18（9）：1484-1487.
[10] 兰洁，杨明，马家骅.重楼提取工艺的研究[J].中草药，2006，37（6）：871-872.
[11] 冯旋，黄文通，陈军.重楼皂苷提取工艺的研究[J].广东药学，2005，15（6）：19.
[12] 孙治国，张琳，李凌军，等.重楼总皂苷提取工艺研究[J].中药材，2007，30（6）：726-729.
[13] 郭莉萍，陈雨，邹卉瑜，等.基于均匀设计优化重楼皂苷提取工艺[J].常熟理工学院学报，2008，22（8）：65-69，94.
关键词：南重楼；重楼皂苷；HPLC法；提取工艺；正交试验
中图分类号：S567.23+9 文献标识码：A 文章编号：0517-6611（2016）07-158-03
Abstract：[Objective] To select the optimal extraction procedure of polyphyllin from four kinds of Paris vietnamensis. [Method] L9（34） orthogonal test was adopted to investigate the four factors of solidliquid ratio， extraction time， initial extraction temperature and extraction times. Polyphyllin contents in four kinds of P. vietnamensis were detected by HPLC method. [Result] The optimal extraction condition was as follows： 15 times of methanol， 20 min extraction time， 40 ℃ extraction temperature， and three extraction times. [Conclusion] This extraction technology is simple， stable， reliable， reasonable and feasible， and can be used for the extraction of polyphyllin from four kinds of P. vietnamensis.
Key words：Paris vietnamensis； Polyphyllin； HPLC method； Extraction technology； Orthogonal design
南重楼Paris vietnamensis（Takht.）H.Li 为百合科重楼属植物，主要分布于贵州，广西西南部、西部，以及云南的东南部、南部和西部，越南北部也有少量分布[1-2]，其以根茎入药，具有清热解毒、散瘀消肿、祛痰、平喘和止血的功能[3]。查阅相关文献表明，重楼皂苷提取方法有超声提取法、微波提取法、酶解法、浸渍法和回流提取法等[4-6]，不同的方法具有各自的优点，超声提取具有方便、能明显缩短提取时间、降低提取温度等优点，因此在重楼提取工艺中应用较多。基于超声提取的这些优点，该试验采用正交试验对提取溶剂的单次料液比、单次提取时间、初始提取温度、提取次数4因素进行优化考察，HPLC法测定4种重楼皂苷含量并作为考察指标，对南重楼中4种重楼皂苷超声提取工艺进行优选，以获取最佳提取工艺。
1：材料与方法
1.1：材料
1.1.1：
仪器。Agilent 1290高效液相色谱仪（G4204A Quat
Pump，G4226A Sampler，G1316C TCC，G4212B DAD）；EL204
十万分之一电子天秤[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；SB25120型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；艾柯DZG303A超纯水机[（台湾艾柯）成都康宁实验专用纯水设备厂]。
1.1.2：
试药。重楼皂苷I、II、VI、VII对照品（贵州迪大生物科技有限责任公司，批号分别为GZDD0605、GZDD0606、GZDD0608、GZDD0609，纯度均达98%以上），流动相所用乙腈、甲醇均为HPLC级色谱纯。其余试剂为分析纯，水为超纯水。
1.1.3：
试材。样品于2014年9月18日采自云南省文山壮族苗族自治州，经大理大学药学与化学学院生药教研室夏从龙教授鉴定为南重楼（Paris vietnamensis）。
1.2：方法
1.2.1：
正交試验。选取甲醇单次料液比（A）、单次提取时间（B）、初始提取温度（C）、提取次数（D）为考察因素，以4种重楼皂苷含量为指标，采用L9（34）正交表（表1）安排试验。
1.2.2：
对照品溶液的制备。准确称取重楼皂苷I、II、VI、VII这4种对照品，溶于甲醇配制成质量浓度分别为0.64、0.46、0.26、0.23 mg/mL的对照品溶液，按1∶1∶1∶1混合，过滤，备用。
1.2.3：
正交试验供试品溶液的制备。根据L9（34）正交设计因素水平表，精密称定南重楼粉末（过40目筛）采用对应提取方式，得到不同提取条件下的提取溶液，过滤，备用。
1.2.4：方法学考察。
1.2.4.1：色谱条件及系统适用性。根据药典方法[7]进行适当的调整，色谱柱为AgilentC18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），检测波长为203 nm，柱温25 ℃；流动相乙腈（A）—水（B）梯度洗脱（0～14 min，30%～40%A；14～40 min，40%A；40～70 min，40%～60%A），流速为0.9 mL/min，进样量5 μL。 1.2.4.2：
标准曲线的绘制。分别精密吸取混合对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积。以进样量X（μg）为横坐标、峰面积Y为纵坐标进行线性回归。
1.2.4.3：
精密度试验。精密吸取对照品溶液连续进样5次，测定重楼皂苷I、II、VI、VII的峰面积，计算RSD值。
1.2.4.4：
稳定性考察。取供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样测定峰面积，计算重楼皂苷I、II、VI、VII峰面积的RSD值。
1.2.4.5：
重复性试验。取样品5份，按最优工艺制备供试品溶液，测定重楼皂苷I、II、VI、VII的含量并计算其RSD。
1.2.4.6：
加样回收率试验。精密称定样品5份，加入各对照品适量，按选定的最优工艺制备供试品溶液。按“1.2.4.1”色谱条件测定重楼皂苷I、II、VI、VII的含量并计算其RSD。
1.2.5：
样品含量测定。吸取供试品溶液和混合对照品溶液，按“1.2.4.1”色谱条件测定各色谱峰的峰面积，利用标准曲线法计算含量。
1.2.6：
验证试验。精密称定样品5份，以选定最优工艺提取，按“1.2.4.1 ”色谱条件测定重楼皂苷I、II、VI、VII的含量以考察最优工艺的稳定性。
2：结果与分析
2.1：方法学考察
2.1.1：
系统适用性。图1表明，在“1.2.4.1”条件下，样品所测主峰旁无明显杂质峰，经计算样品峰与其他峰的分离度>1.5，理论塔板数按重楼皂苷I、II、VI、VII计算均不低于10 000，符合含量测定要求。
2.1.2：
标准曲线的绘制。按“1.2.4.2”测定，以进样量X（μg）为横坐标、峰面积Y为纵坐标得出重楼皂苷I、II、VI、VII的线性回归方程分别为YI=366.44XI+3.07（r=0999 9）、YII=377.60XII+2.42（r=0.999 9）、YVI=34035XVI+1.63（r=0.999 9）、YVII=344.22XVII+0.37（r=0.999 9），表明重楼皂苷I、II、VI、VII分别在0.64～12.80、0.46～9.20、0.26～5.20、0.23～4.60 μg范围内线性关系良好。
2.1.3：
精密度试验。连续进样5次，重楼皂苷I、II、VI、VII峰面积的RSD分别为2.34%、2.06%、2.17%、2.10%，表明该方法精密度良好。
2.1.4：
稳定性考察。按“1.2.4.4”操作，重楼皂苷I、II、VI、VII峰面积的RSD分别为2.02%、2.71%、2.72%、2.98%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.1.5：
重复性试验。平行样5份，测定重楼皂苷I、II、VI、VII的含量，其含量的RSD分别为0.54%、2.15%、1.91%、278%，表明方法重复性良好。
2.1.6：
加样回收率试验。按“1.2.4.6”操作，测定重楼皂苷I、II、VI、VII的平均回收率分别为101.04%、101.73%、9869%、101.17%，RSD分别为1.33%、2.34%、1.64%、217%。
2.2：样品含量测定：
按L9（34）正交表进行试验，结果表明（表2），南重楼中重楼皂苷的最佳提取工艺为A3B2C2D3组合，即15倍的溶媒，每次提取20 min，初始提取温度为40 ℃，提取3次，极差R顺序为D>C>A>B，即所考察因素中提取次数对重楼皂苷的提取率影响最大，其次为初始提取温度、甲醇单次料液比、单次提取时间。
2.3：验证试验：
由表3可知，通过选定的最优工艺提取的样品，其总含量的平均值为13.349 mg/g，RSD=0.84%，表明该工艺达到了优化目的且稳定性良好。
3：讨论与结论
近年来已有很多研究通过正交试验来优化重楼皂苷的提取工艺[8-12]，卢伟等[9]采用正交试验优选出重楼甾体皂苷最佳提取工艺为90%的乙醇溶液加热回流提取，料液比为1∶12，提取3次，每次1 h；冯旋等[11]采用正交试验优选出提取重楼甾体皂苷的最佳工艺为4倍于生药量的70%乙醇回流提取3次，每次2 h；郭莉萍等[13]基于均匀设计优化出重楼皂苷提取的最佳工艺为加热回流时间20 min、浸泡时间29.02 h、提取液乙醇浓度39.68%、加热回流次数8次，但各提取工藝不尽相同，且总皂苷的含量也各不相同。而该试验综合以上试验全面地考察了南重楼中4种重楼皂苷的提取工艺，试验采用HPLC法测定4种重楼皂苷含量并作为考察指标，以L9（34）正交试验考察了超声提取4种重楼皂苷中不
同因素对提取率的影响，结果表明，对重楼皂苷提取率影响最大的因素为提取次数，其次为初始提取温度和甲醇单次料液比，影响最小的为单次提取时间；得出最佳工艺为甲醇单次料液比1∶15、每次提取20 min、初始提取温度为40 ℃、提取3次，最优
工艺验证试验结果表明该方法可行、重复性好、稳定可靠，可用于南重楼中4种重楼皂苷的提取，通过该试验进一步优化南重楼中4种重楼皂苷的提取工艺，为南重楼中4种重楼皂苷的提取提供理论依据。
参考文献
[1] 中国科学院中国植物志编委员会.中国植物志：第15卷[M].北京：科学出版社，1978：86.
[2] 中国科学院昆明植物研究所.云南植物志：第8卷（下）[M].北京：科学出版社，2006：664.
[3] 黄芸，崔力剑，王强，等.南重楼 Paris vietnamensis活性物质的分离与鉴定[J].药学学报，2006，41（4）：361-364.
[4] 兰洁，杨明，马家骅.重楼提取工艺的研究[J].中草药，2006，37（6）：871-872.
[5] 冯旋，黄文通，陈军.重楼皂苷提取工艺的研究[J].广东药学，2005，15（6）：19.
[6] 叶方，杨光义，李志荣，等.重楼皂苷的提取工艺及质量控制研究概述[J].中国药师，2011，14（8）：1207-1209.
[7] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：260.
[8] 李维莉，彭永芳，李银，等.超声法提取重楼中重楼皂苷的研究[J].中成药，2010，32（2）：218-220.
[9] 卢伟，杨光义，叶方，等.正交试验设计优选重楼总皂苷提取工艺[J].中国药师，2015，18（9）：1484-1487.
[10] 兰洁，杨明，马家骅.重楼提取工艺的研究[J].中草药，2006，37（6）：871-872.
[11] 冯旋，黄文通，陈军.重楼皂苷提取工艺的研究[J].广东药学，2005，15（6）：19.
[12] 孙治国，张琳，李凌军，等.重楼总皂苷提取工艺研究[J].中药材，2007，30（6）：726-729.
[13] 郭莉萍，陈雨，邹卉瑜，等.基于均匀设计优化重楼皂苷提取工艺[J].常熟理工学院学报，2008，22（8）：65-69，94.