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摘 要:【目的】从和田维吾尔族长寿老人粪便中筛选并鉴定定植肠道的益生乳酸菌,通过数量和种类与一般人进行比较,为后续筛选高抑菌活性,具有降胆固醇功能的菌株提供基础。【方法】首先用微生物平板计数法统计粪便中的细菌总数,然后用改良的MRS+CaCO3固体培养基筛选乳酸菌,经形态学、生理生化实验进行初步鉴定,挑选出18株长寿老人源肠道乳酸菌和9株一般人源肠道乳酸菌,并进行16S rDNA序列鉴定。【结果】从和田长寿老人粪便中分离得到乳酸菌18株,其中8株属于植物乳杆菌,10株属于肠球菌,一般人粪便中分离得到乳酸菌9株,都属于肠球菌。长寿老人肠道中肠球菌占优势,但是一般人肠道中没有植物乳杆菌,只有肠球菌。【结论】经形态学,生理生化,分子鉴定等方法从和田长寿老人肠道中分离出的27株乳酸菌属于肠球菌和植物乳杆菌的不同变异品系,为进一步研究抑菌活性,降胆固醇功能,安全性并益生菌与长寿的关系奠定一定的基础。
关键词:和田 长寿老人 乳酸菌 分离与鉴定
中图分类号:Q 文献标识码:A 文章编号:1674-098X(2012)03(a)-0228-03
乳酸菌是人体肠道内重要的生理性有益菌,具有维持胃肠道正常的微生态平衡、抑制病原菌的入侵和感染以及增强机体免疫力等生理作用。
新疆和田地区是世界五大长寿区之一,我国的生物学家和医学家曾对我国著名的长寿地区进行多次调查和研究,总结了基因和自然环境因素的影响等两个方面是百岁老人长寿的原因。他们研究中的环境因素主要局限于群体的居住环境、食物构成、空气、水质等等,而长期忽略了一个非常重要的因素—人类共生微生物。人类共生微生物是构成人体的一个不可缺少的部分:人类自身的细胞总数大约有60兆个,而健康人自身携带的共生微生物的数量可以达到1000兆以上,即大于人體自身细胞数的100倍。这个数量级的生物并不是人类的身外之物,而是与人类共生共存,成为互相依存的共生体。人类的消化系统、皮肤表面从里到外都分布满了各种微生物,他们决定人体的消化、免疫、代谢,人类的生存质量,甚至左右人类的情绪。研究发现益生乳酸菌对人体有降胆固醇、降血压和调节肠道微生态等多种保健功能。
本研究首次我国和田地区90岁以上维吾尔族长寿老人粪便为实验材料,一般人和长寿老人的后代婴儿粪便作为对照组,按传统的形态学观察、生理生化试验和糖发酵试验分离出27株乳酸菌,并通过16Sr DNA序列分析方法准确地对该
菌株进行种属归类,为进一步研究乳酸菌的益生功能,以便探讨肠道益生菌与长寿的关系奠定了一定的基础。
1 实验材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品的来源
从新疆和田墨玉县采取的长寿老人及其对照组(一般人和长寿老人的后代婴儿)的粪便做实验材料。
1.1.2 培养基
改良的MRS固体培养基:用于乳酸菌的分离纯化。
MRS半固体培养基:观察乳酸菌的运动性。
MRS液体培养基:用于乳酸菌的活化与理化鉴定。
明胶培养基、柠檬酸铁铵琼脂柱培养基(H2S试验)、蛋白胨水培养基(吲哚实验)、葡萄糖发酵培养基、硝酸盐培养基:用于生理生化鉴定。
1.1.3 药品
药品均为市售分析纯。
1.1.4 仪器与设备
高压灭菌锅:上海博迅公司;GXZ型智能光照培养箱:宁波江南仪器厂;722s分光光度计752C:上海第三分析仪器厂;奥特光学BK系列生物显微镜:重庆奥特光学仪器有限公司;JD200-3型电子天平:沈阳龙腾电子称量仪器有限公司;SWCJ-1F型超净工作台:江苏苏净安泰空气技术有限公司;哈纳酸度离子计pH211:北京哈纳科仪科技有限公司;
1.2 方法
1.2.1 细菌总数的测定
称取1.0g样品,加入到装有9.0ml无菌生理盐水的试管中,吸取菌液进行10倍梯度稀释,得到10-1、10-2、10-3、10-44个稀释度。用经灭菌并冷却到45℃～50℃的细菌培养基倾倒平板,37℃培养48h,放在37℃的培养箱培养两天后观察并记录细菌数目。
1.2.2 乳酸菌的分离
称取1.0g样品,加入到装有9.0ml无菌生理盐水的试管中,吸取菌液进行10倍梯度稀释,得到10-1、10-2、10-3、10-44个稀释度。用经灭菌并冷却到45～50℃的含有CaCO3的改良MRS固体培养基倾倒平板,上面覆盖一层营养琼脂,37℃培养48h,挑取浅蓝色的,有溶钙圈的菌落,转移到MRS平板上,直到得到单菌落为止。每一个单菌落接一个装有5mlMRS液体培养基的试管,上面导入一层已灭菌的液体石蜡,37℃培养48h。
1.2.3 乳酸菌的初步鉴定
(1)形态学鉴定:对分离得到的乳酸菌进行菌落形态观察,进行革兰氏染色。
(2)生理生化鉴定:对筛选的革兰氏阳性菌菌株分别进行接触酶实验、硝酸盐还原实验、明胶液化实验、产H2S实验、吲哚实验、葡萄糖产酸产气实验、碳水化合物发酵产酸试验,运动性实验,检测在pH 4.5,温度15℃、45℃,6.5％ NaCl下的生长情况。
1.2.4 16S rDNA序列鉴定
对被选的27株乳酸菌菌株进行16S rDNA序列鉴定,DNA提取方法参照参考文献。
将提取所得的DNA模板进行PCR扩增,采用正向引物27f:5,-AGAGTTT GATCC
TGGCTCAG-3,反向引物1492R:5,-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。
PCR反应体系(25μL):引物(10μmol/L):各引物1μL;10×PCR Buffer:2.5μL;dNTP mix:2μL;Taq 酶:0.3μL;模板:1μL;超纯水补足至25μL。
PCR反应条件为:94℃4min,94℃ 30s,54℃ 30min,72℃ 2min,32个循环,最后72℃延伸10min。取扩增产物3μL,用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测,电泳液为0.5×TBE。
2 结果与分析
2.1 细菌总数的测定(如表1)
从表可以看出,长寿老人肠道中益生菌的数量比一般人肠道中的多。
2.2 菌株的分离、纯化
通过以上的方法已分离到乳酸菌27株。
2.3 乳酸菌初步鉴定
(1)形态学鉴定:
a:菌落观察:菌落皆为浅蓝色或乳白色,圆形,形成钙溶圈,直径约为1-3mm。
b:革兰氏染色:27株菌是球菌和杆菌,革兰氏阳性菌,或丛生、或对生。
(2)菌类鉴定:筛选得到27株菌皆符合乳酸菌的性质:革兰氏阳性菌,接触酶阴性。乳酸菌的鉴定结果如表2、表3所示:
备注:“+”表示阳性,“-”表示阴性;
Note:“+”means positive reaction,- means negative reaction
从表1,表2可以看出,已分离的27株乳酸菌均为革兰氏染色阳性,不运动,在H2O2酶实验、H2S实验、明胶液化实验、吲哚实验、硝酸盐还原实验、葡萄糖产气实验呈阴性,都能在15℃,45℃,pH4.5,6.5％ NaCl生长良好,不发酵蔗糖和木糖,能发酵葡萄糖和乳糖。
2.4 序列分析和系统发育树的构建
16SrDNA基因序列在Eztaxon server 2.1中进行序列比对,得出R01-21,R01-23,R02-23,R03-12,R03-13,R03-37,R05-23,R05-34,R05-35,R05-39,R7-28,R08-22,R08-23,R08-28,R09-11,S03,S04,S08,S10为肠球菌,与其序列同源性高达99.158%以上,R01-22,R02-22,R02-24,R03-16,R03-114,R04-31,R02-25,S06为植物乳杆菌,与其序列同源性高达98.169%以上。序列提交GenBank注册,得到序列号R01-21(HQ603855)、R01-22(HQ603856)、R01-23(HQ603857)、R02-22(HQ603858)、R02-23(HQ603859)、R02-24(HQ603860)、R02-25(HQ603861)、R03-16(HQ603862)、R03-37(HQ603863)、R03-114(HQ603864)、R03-12(JF896447)、R03-13(JF896446)、R04-31(HQ603865)、R05-23(JF896441)、R05-34(JF896444)、R05-35(JF896434)、R05-39(JF896437)、R07-28(JF896436)、R08-22(JF896435)、R08-23(JF896440)、R08-28(JF896442)、R09-11(JF896443)、S03(JF896449)、S04(JF896438)、S06(JF896439)、S08(JF896445)、S10(JF896448)、并用MEGA4.1软件绘制系统发育树,采用临近法绘制进化树。结果如图1所示:
从图1可以看出:从图1可以看出:R02-23(HQ603859),R01-21(HQ603855),R09-11(JF896443)、R05-35(JF896434),R08-23(JF896440),R05-39(JF896437),R05-34(JF896444),R03-13(JF896446),R08-22(JF896435),R08-28(JF896442),R03-37(HQ603863),S03(JF896449),S08(JF896445),S10(JF896448),R03-12(JF896447),R05-23(JF896441)为Enterococcus durans的不同变异品系;R07-28(JF896436)为Enterococcus faecium的變异品系;R02-25(HQ603861)为Lactobacillus paracasei subsp.paracasei的变异品系;S06(JF896439)为Lactobacillus plantarum subsp. Argentoratensis的变异品系;R02-22(HQ603858),R02-24(HQ603860),R03-16(HQ603862),R01-22(HQ603856),R03-16(HQ603862),R03-114(HQ603864),R04-31(HQ603865)为Lactobacillus plantarum subsp.Plantarum的变异品系。
3 结论
从和田维吾尔族长寿老人粪便中分离得到乳酸菌27株,通过形态学,生理生化和16S rDNA序列分析并参阅《伯杰士细菌学手册》(第九版)及《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》鉴定为肠球菌和植物乳杆菌。本实验结果表明,和田长寿老人和一般人肠道中的益生菌不仅从数量上有差异,而且种类上也有差异,也就是说长寿老人肠道中肠球菌占优势,还有植物乳杆菌而一般人肠道中只能存在肠球菌。
肠道乳酸菌是肠道中占优势的益生菌之一,我国对部分菌种的抑菌性能进行了研究,但对于各种益生功能的研究,技术性能和安全性能评价,将还需要大量的工作。我国对益生菌的降血脂功能和优良菌种的选育等方面的研究还是初步阶段,因此来自人体肠道的益生菌的降胆固醇研究还未见报道,机理研究更是空白。益生菌抑菌性能的研究在国内相对较多,但来源于人体的优良菌株的筛选还需要大量的工作[14-16]。
为了补充这些空白本实验的后续工作中我们从已鉴定的27株乳酸菌中筛选出抑菌活性比较强,有降胆固醇功能,安全性高的益生菌菌株并该菌株与长寿的关系进行初步研究。长寿成为全世界人们共同话题的情况下本研究的进行从开发新的益生菌产品,促进人类健康,延长人类岁数等方面具有重要的现实意义和广阔的应用前景。
参考文献
[1] 王斌,李秋荣,刘放南等.1株肠道高黏附性乳杆菌的分离鉴定[J].中国生物制品学杂志,2008.
[2] 于景华,李里特.健康人肠道益生菌的分离,筛选,功能特性及应用研究[D].中国农业大学,2006.
[3] 赵佳锐,杨虹.人体肠道益生菌的分离鉴定、抑菌和降脂功能研究[D].上海交通大学,2005.
[4] 李云天,袁越.百岁老人现状及长寿经验研究[J].中国长寿网.2007.
[5] 东秀珠,蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册[M]．北京:科学出版社,2001.
[6] 孙雪.双歧杆菌的分离纯化及其培养技术的初步研究[D].河南科技大学,2005.
①基金项目:新疆特殊环境微生物实验室开放课题基金(XJYS0203-2009-03)和中国科学院心理研究所合作项目(140696)
①作者简介:麦热姆妮萨·艾麦尔(1980年～),女,研究生,研究方向:资源微生物。
乌斯满·依米提(1962～)、男、副教授、博士、研究方向-微生物资源开发
关键词:和田 长寿老人 乳酸菌 分离与鉴定
中图分类号:Q 文献标识码:A 文章编号:1674-098X(2012)03(a)-0228-03
乳酸菌是人体肠道内重要的生理性有益菌,具有维持胃肠道正常的微生态平衡、抑制病原菌的入侵和感染以及增强机体免疫力等生理作用。
新疆和田地区是世界五大长寿区之一,我国的生物学家和医学家曾对我国著名的长寿地区进行多次调查和研究,总结了基因和自然环境因素的影响等两个方面是百岁老人长寿的原因。他们研究中的环境因素主要局限于群体的居住环境、食物构成、空气、水质等等,而长期忽略了一个非常重要的因素—人类共生微生物。人类共生微生物是构成人体的一个不可缺少的部分:人类自身的细胞总数大约有60兆个,而健康人自身携带的共生微生物的数量可以达到1000兆以上,即大于人體自身细胞数的100倍。这个数量级的生物并不是人类的身外之物,而是与人类共生共存,成为互相依存的共生体。人类的消化系统、皮肤表面从里到外都分布满了各种微生物,他们决定人体的消化、免疫、代谢,人类的生存质量,甚至左右人类的情绪。研究发现益生乳酸菌对人体有降胆固醇、降血压和调节肠道微生态等多种保健功能。
本研究首次我国和田地区90岁以上维吾尔族长寿老人粪便为实验材料,一般人和长寿老人的后代婴儿粪便作为对照组,按传统的形态学观察、生理生化试验和糖发酵试验分离出27株乳酸菌,并通过16Sr DNA序列分析方法准确地对该
菌株进行种属归类,为进一步研究乳酸菌的益生功能,以便探讨肠道益生菌与长寿的关系奠定了一定的基础。
1 实验材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品的来源
从新疆和田墨玉县采取的长寿老人及其对照组(一般人和长寿老人的后代婴儿)的粪便做实验材料。
1.1.2 培养基
改良的MRS固体培养基:用于乳酸菌的分离纯化。
MRS半固体培养基:观察乳酸菌的运动性。
MRS液体培养基:用于乳酸菌的活化与理化鉴定。
明胶培养基、柠檬酸铁铵琼脂柱培养基(H2S试验)、蛋白胨水培养基(吲哚实验)、葡萄糖发酵培养基、硝酸盐培养基:用于生理生化鉴定。
1.1.3 药品
药品均为市售分析纯。
1.1.4 仪器与设备
高压灭菌锅:上海博迅公司;GXZ型智能光照培养箱:宁波江南仪器厂;722s分光光度计752C:上海第三分析仪器厂;奥特光学BK系列生物显微镜:重庆奥特光学仪器有限公司;JD200-3型电子天平:沈阳龙腾电子称量仪器有限公司;SWCJ-1F型超净工作台:江苏苏净安泰空气技术有限公司;哈纳酸度离子计pH211:北京哈纳科仪科技有限公司;
1.2 方法
1.2.1 细菌总数的测定
称取1.0g样品,加入到装有9.0ml无菌生理盐水的试管中,吸取菌液进行10倍梯度稀释,得到10-1、10-2、10-3、10-44个稀释度。用经灭菌并冷却到45℃～50℃的细菌培养基倾倒平板,37℃培养48h,放在37℃的培养箱培养两天后观察并记录细菌数目。
1.2.2 乳酸菌的分离
称取1.0g样品,加入到装有9.0ml无菌生理盐水的试管中,吸取菌液进行10倍梯度稀释,得到10-1、10-2、10-3、10-44个稀释度。用经灭菌并冷却到45～50℃的含有CaCO3的改良MRS固体培养基倾倒平板,上面覆盖一层营养琼脂,37℃培养48h,挑取浅蓝色的,有溶钙圈的菌落,转移到MRS平板上,直到得到单菌落为止。每一个单菌落接一个装有5mlMRS液体培养基的试管,上面导入一层已灭菌的液体石蜡,37℃培养48h。
1.2.3 乳酸菌的初步鉴定
(1)形态学鉴定:对分离得到的乳酸菌进行菌落形态观察,进行革兰氏染色。
(2)生理生化鉴定:对筛选的革兰氏阳性菌菌株分别进行接触酶实验、硝酸盐还原实验、明胶液化实验、产H2S实验、吲哚实验、葡萄糖产酸产气实验、碳水化合物发酵产酸试验,运动性实验,检测在pH 4.5,温度15℃、45℃,6.5％ NaCl下的生长情况。
1.2.4 16S rDNA序列鉴定
对被选的27株乳酸菌菌株进行16S rDNA序列鉴定,DNA提取方法参照参考文献。
将提取所得的DNA模板进行PCR扩增,采用正向引物27f:5,-AGAGTTT GATCC
TGGCTCAG-3,反向引物1492R:5,-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。
PCR反应体系(25μL):引物(10μmol/L):各引物1μL;10×PCR Buffer:2.5μL;dNTP mix:2μL;Taq 酶:0.3μL;模板:1μL;超纯水补足至25μL。
PCR反应条件为:94℃4min,94℃ 30s,54℃ 30min,72℃ 2min,32个循环,最后72℃延伸10min。取扩增产物3μL,用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测,电泳液为0.5×TBE。
2 结果与分析
2.1 细菌总数的测定(如表1)
从表可以看出,长寿老人肠道中益生菌的数量比一般人肠道中的多。
2.2 菌株的分离、纯化
通过以上的方法已分离到乳酸菌27株。
2.3 乳酸菌初步鉴定
(1)形态学鉴定:
a:菌落观察:菌落皆为浅蓝色或乳白色,圆形,形成钙溶圈,直径约为1-3mm。
b:革兰氏染色:27株菌是球菌和杆菌,革兰氏阳性菌,或丛生、或对生。
(2)菌类鉴定:筛选得到27株菌皆符合乳酸菌的性质:革兰氏阳性菌,接触酶阴性。乳酸菌的鉴定结果如表2、表3所示:
备注:“+”表示阳性,“-”表示阴性;
Note:“+”means positive reaction,- means negative reaction
从表1,表2可以看出,已分离的27株乳酸菌均为革兰氏染色阳性,不运动,在H2O2酶实验、H2S实验、明胶液化实验、吲哚实验、硝酸盐还原实验、葡萄糖产气实验呈阴性,都能在15℃,45℃,pH4.5,6.5％ NaCl生长良好,不发酵蔗糖和木糖,能发酵葡萄糖和乳糖。
2.4 序列分析和系统发育树的构建
16SrDNA基因序列在Eztaxon server 2.1中进行序列比对,得出R01-21,R01-23,R02-23,R03-12,R03-13,R03-37,R05-23,R05-34,R05-35,R05-39,R7-28,R08-22,R08-23,R08-28,R09-11,S03,S04,S08,S10为肠球菌,与其序列同源性高达99.158%以上,R01-22,R02-22,R02-24,R03-16,R03-114,R04-31,R02-25,S06为植物乳杆菌,与其序列同源性高达98.169%以上。序列提交GenBank注册,得到序列号R01-21(HQ603855)、R01-22(HQ603856)、R01-23(HQ603857)、R02-22(HQ603858)、R02-23(HQ603859)、R02-24(HQ603860)、R02-25(HQ603861)、R03-16(HQ603862)、R03-37(HQ603863)、R03-114(HQ603864)、R03-12(JF896447)、R03-13(JF896446)、R04-31(HQ603865)、R05-23(JF896441)、R05-34(JF896444)、R05-35(JF896434)、R05-39(JF896437)、R07-28(JF896436)、R08-22(JF896435)、R08-23(JF896440)、R08-28(JF896442)、R09-11(JF896443)、S03(JF896449)、S04(JF896438)、S06(JF896439)、S08(JF896445)、S10(JF896448)、并用MEGA4.1软件绘制系统发育树,采用临近法绘制进化树。结果如图1所示:
从图1可以看出:从图1可以看出:R02-23(HQ603859),R01-21(HQ603855),R09-11(JF896443)、R05-35(JF896434),R08-23(JF896440),R05-39(JF896437),R05-34(JF896444),R03-13(JF896446),R08-22(JF896435),R08-28(JF896442),R03-37(HQ603863),S03(JF896449),S08(JF896445),S10(JF896448),R03-12(JF896447),R05-23(JF896441)为Enterococcus durans的不同变异品系;R07-28(JF896436)为Enterococcus faecium的變异品系;R02-25(HQ603861)为Lactobacillus paracasei subsp.paracasei的变异品系;S06(JF896439)为Lactobacillus plantarum subsp. Argentoratensis的变异品系;R02-22(HQ603858),R02-24(HQ603860),R03-16(HQ603862),R01-22(HQ603856),R03-16(HQ603862),R03-114(HQ603864),R04-31(HQ603865)为Lactobacillus plantarum subsp.Plantarum的变异品系。
3 结论
从和田维吾尔族长寿老人粪便中分离得到乳酸菌27株,通过形态学,生理生化和16S rDNA序列分析并参阅《伯杰士细菌学手册》(第九版)及《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》鉴定为肠球菌和植物乳杆菌。本实验结果表明,和田长寿老人和一般人肠道中的益生菌不仅从数量上有差异,而且种类上也有差异,也就是说长寿老人肠道中肠球菌占优势,还有植物乳杆菌而一般人肠道中只能存在肠球菌。
肠道乳酸菌是肠道中占优势的益生菌之一,我国对部分菌种的抑菌性能进行了研究,但对于各种益生功能的研究,技术性能和安全性能评价,将还需要大量的工作。我国对益生菌的降血脂功能和优良菌种的选育等方面的研究还是初步阶段,因此来自人体肠道的益生菌的降胆固醇研究还未见报道,机理研究更是空白。益生菌抑菌性能的研究在国内相对较多,但来源于人体的优良菌株的筛选还需要大量的工作[14-16]。
为了补充这些空白本实验的后续工作中我们从已鉴定的27株乳酸菌中筛选出抑菌活性比较强,有降胆固醇功能,安全性高的益生菌菌株并该菌株与长寿的关系进行初步研究。长寿成为全世界人们共同话题的情况下本研究的进行从开发新的益生菌产品,促进人类健康,延长人类岁数等方面具有重要的现实意义和广阔的应用前景。
参考文献
[1] 王斌,李秋荣,刘放南等.1株肠道高黏附性乳杆菌的分离鉴定[J].中国生物制品学杂志,2008.
[2] 于景华,李里特.健康人肠道益生菌的分离,筛选,功能特性及应用研究[D].中国农业大学,2006.
[3] 赵佳锐,杨虹.人体肠道益生菌的分离鉴定、抑菌和降脂功能研究[D].上海交通大学,2005.
[4] 李云天,袁越.百岁老人现状及长寿经验研究[J].中国长寿网.2007.
[5] 东秀珠,蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册[M]．北京:科学出版社,2001.
[6] 孙雪.双歧杆菌的分离纯化及其培养技术的初步研究[D].河南科技大学,2005.
①基金项目:新疆特殊环境微生物实验室开放课题基金(XJYS0203-2009-03)和中国科学院心理研究所合作项目(140696)
①作者简介:麦热姆妮萨·艾麦尔(1980年～),女,研究生,研究方向:资源微生物。
乌斯满·依米提(1962～)、男、副教授、博士、研究方向-微生物资源开发