【摘 要】
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目的:探索CRISPR干扰(CRISPR interference,CRISPRi)特异性抑制肝癌细胞Hep G2内源性miR-122表达.方法:设计靶向mi R-122启动子区TATA盒和转录起始位点(transcription start
【机 构】
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山东省消化系统疾病防治中心,济宁市第一人民医院消化内科
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目的:探索CRISPR干扰(CRISPR interference,CRISPRi)特异性抑制肝癌细胞Hep G2内源性miR-122表达.方法:设计靶向mi R-122启动子区TATA盒和转录起始位点(transcription start site,TSS)的sg RNA(sg T1和sg T2),与无DNA内切酶活性仅保留识别特性的d Cas9-KRAB载体共转染Hep G2细胞,通过实时定量PCR(quantitative Real-time PCR,qR T-PCR)方法检测miR-122的表达并确立有效的sgR NA;设计不同的sgR NA浓度,探索CRISPRi抑制作用的剂量依赖性;通过qR T-PCR及Western blot方法检测miR-122靶分子HOMX1和CyclinG 1的表达变化.结果:sg T1和sg T2介导的CRISPRi分别将肝癌细胞Hep G2内源性mi R-122的表达水平抑制5.5倍(P<0.01)和3.7倍(P<0.01);CRIPSRi抑制效应是sgR NA剂量依赖性的,当lentiG uidePuro-sgT 1质粒为500 ng时,可将miR-122的表达抑制10.0倍(P<0.01);CRIPSRi抑制肝癌细胞Hep G2内源性mi R-122表达的同时,上调了mi R-122下游靶分子HMOX1和Cyclin G1的表达.结论:本研究利用CRISPRi技术实现了对肝癌细胞Hep G2内源性mi R-122表达的特异性抑制,为抗丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)提供了全新的策略.
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