【摘 要】
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目的 探究鱼精蛋白硫酸盐对四面体框架核酸入胞能力及胞内稳定性的影响.方法 取3日龄C57BL小鼠肢端软骨进行软骨细胞培养,并收集第1～2代细胞用于实验.利用4条DNA单链S1(标记Cy
【机 构】
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口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 四川大学华西口腔医院 成都 610041
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目的 探究鱼精蛋白硫酸盐对四面体框架核酸入胞能力及胞内稳定性的影响.方法 取3日龄C57BL小鼠肢端软骨进行软骨细胞培养,并收集第1～2代细胞用于实验.利用4条DNA单链S1(标记Cy5荧光)、S2、S3、S4,经过退火程序合成四面体框架核酸并超滤提纯.用高通量毛细电泳验证四面体框架核酸合成并拍摄透射电镜图进行表征.向新合成四面体框架核酸中缓慢滴入1 mg/mL鱼精蛋白硫酸盐溶液(以原子数N/P=5/1混合),检测Zeta电位.将细胞分为3组:细胞中加入100 nmol/L经过鱼精蛋白硫酸盐孵育的四面体框架核酸作为实验组1;细胞中加入100 nmol/L未经孵育处理的四面体框架核酸为实验组2;对照组细胞不进行加药处理.在加药后6 h及12 h,用流式细胞术定量检测胞内Cy5荧光,并取部分12 h组细胞,进行免疫荧光染色,于激光共聚焦显微镜下定性观察分析胞内Cy5荧光.加药5.5 h及11.5 h后,加入溶酶体探针对活细胞溶酶体进行染色,30 min后(6 h及12 h)观察Cy5荧光与溶酶体位置关系.结果 经过鱼精蛋白硫酸盐孵育处理后,溶液Zeta电位由负转正,即由(-1.567±0.163)mV转为(4.700±0.484)mV;在6 h及12 h两个时间点,流式细胞仪检测到实验组1胞内四面体框架核酸荧光强度均高于实验组2,差异有统计学意义(P<0.05).12 h的免疫荧光染色观察结果与流式细胞术检测结果一致.溶酶体染色结果显示,加药6 h及12 h后,实验组1的Cy5荧光与溶酶体位置重叠现象较实验组2更少;且12 h后,实验组1依然可见大量Cy5荧光,而实验组2的Cy5荧光较少较弱.结论 鱼精蛋白硫酸盐孵育处理可有效提升四面体框架核酸入胞能力,并在一定程度上实现四面体框架核酸胞内溶酶体的逃逸.
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