器官型脑片培养OGD复氧模型中丁苯酞对于bcl-2/bax及bim蛋白的调节作用

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目的:建立大脑皮层的器官型脑片氧糖剥夺模型(Oxygen andGlucose Deprivation,OGD),观察OGD复氧模型中丁苯酞(NBP)对细胞凋亡中bcl-2、bax及bim蛋白的调节作用。方法:用生后7天的SD(Sprague Dawley)乳大鼠,制备大脑皮层运动区的器官型脑片,用膜插件的方法进行体外培养,观察其形态。2周后,将脑片随机分为对照组(C组)、模型组(M组)、溶剂对照组(MT组)和实验组(T10组),每组九片,更换含有Propidium iodide(PI,1μg/ml)的培养液,孵育20min,倒置荧光显微镜下拍照(4X,曝光时间1.038ms,灵敏度ISO1600),后模型组、溶剂对照组和实验组采用厌氧罐氧剥夺,更换无糖培养液(含PI)的方式,进行OGD干预30min,之后更换正常糖含量培养液,溶剂对照组更换同实验组等量溶剂(DMSO)的正常培养液(含PI),实验组更换含NBP(10μM)的正常培养液(含PI),对照组与实验组同一时间更换两次正常培养液。分别在干预前和恢复正常条件后不同时间点(1h、24h、72h),观察PI染色。另外,对照组、模型组和实验组,重复上述干预(培养液不添加PI),复氧6小时后用戊二醛固定,并做石蜡切片,进行HE染色及对各组进行bcl-2、bax、bim蛋白的免疫组化染色。结果:1体外培养的脑片存活良好,未见明显的坏死区域。2周的脑片,进行HE染色,可见正常的细胞结构。2PI染色可见对照组在不同的时间点荧光强度并未发生明显变化(P>0.05),模型组和溶剂对照组可见荧光强度在OGD复氧1h后有明显增强,之后在24h、72h逐渐增强。两组进行各时间点比较其荧光强度未见明显差异(P>0.05)。3实验组荧光强度也呈现逐渐增强趋势,但与模型组比较,在24h、72h其荧光强度均低于模型组。4免疫组化染色可见对照组、模型组和实验组处理后6小时的石蜡切片中。bcl-2蛋白:模型组和实验组阳性细胞数均增多,实验组增多更明显,三组差异均具有统计学意义;bax蛋白:模型组和实验组阳性细胞数均增多,模型组增多更明显,三组之间差异均有统计学意义;bim蛋白:模型组和实验组阳性细胞数均增多,模型组增多更明显,三组之间差异均有统计学意义。结论:1出生后7天的SD乳鼠可以作为体外脑片培养的脑组织供体,并且可以以此为平台,对脑细胞进行不同条件的刺激来研究神经细胞的不同反应;2OGD模型可以诱导脑片损伤,出现急性的细胞死亡和迟发性细胞凋亡,可以模拟在体的缺血缺氧后脑组织损伤,重复性良好;3NBP对OGD后的细胞损伤具有保护作用,其可能通过对bcl-2、bax以及bim蛋白的调节从而减少细胞的凋亡。
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