一、研究背景卵巢癌是死亡率最高的女性生殖系统恶性肿瘤,尽管在理想肿瘤细胞减灭术(CRS)的基础上辅助铂类为基础化疗的治疗策略在卵巢癌(OC)患者中取得了很高的应答率,但晚期患者5年生存率仅为30%左右[1-3]。肿瘤的反复复发和对于化疗耐药是主要的原因[4]。深入探讨卵巢癌复发和耐药的机制是改善这一状况的途径之。近年的研究表明,肿瘤是由不同恶性程度的异质性细胞组成的混合物,其中极小部分具有自我更新、分化和肿瘤起始能力的细胞亚群被称为肿瘤干细胞(CSCs)或肿瘤起始细胞(TICs)[5]。1858年Virchow首次提出了具有干细胞(SC)特性的肿瘤细胞的概念。1875年科恩海姆改进了这一模型,提出胚胎样细胞保留在成人组织中,在生命后期被激活后发展成肿瘤[6-7]。肿瘤干细胞理论认为:在异构的卵巢肿瘤中,有极小部分的群体(通常少于2%的细胞),具有比其它肿瘤细胞更强的致瘤、分化能力[8-10]。卵巢癌为一种干细胞疾病的有其合理的原因:首先,卵巢癌的临床过程。卵巢癌多数为化疗敏感肿瘤,即使是复发后仍有很大部分患者对化疗依然敏感,在不断的复发过程中肿瘤的无铂化疗间期不断缩短,一般从第二次复发后就逐渐走入耐药。说明这种复发肿瘤是由多数化疗敏感细胞与极少量耐药细胞组成的异质性群体,经过多轮化疗后存活的细胞群体存在分化能力[9]。其次,卵巢癌发生的病理过程。卵巢表面上皮细胞(OSE)在基因水平上具有更多的间充质成分被表达,且分化程度较低[11]。如何分离出具有增殖和分化能力的卵巢癌干细胞成为验证这一科学设想的关键问题。目前一些标记物是基于功能分析,如侧群体(SP)、基于蛋白质的表达[8]。寻找卵巢癌特异性的表面标记蛋白并探索其作用机制,探讨卵巢癌的发病与耐药机制以及可能的靶向治疗意义重大。本课题组先后两次受国家自然科学基金资助,通过微量蛋白组学及比较蛋白组学分析技术,筛选出了卵巢癌表面标记候选蛋白CDC50A。通过体外及体内实验充分证明了 CDC50A是卵巢癌干细胞的表面标记蛋白。进一步利用RNA干扰技术证实卵巢癌细胞中CDC50A表达上调后可显著增强卵巢癌的干细胞特性。在研究CDC50A发挥干细胞作用机制时,利用半定量PCR技术发现了 P4型腺苷三磷酸酶磷脂转移蛋白家族(P4 family of ATPase phospholipid transporting,简称 P4-ATPases)中的ATP11A、ATP11B在CDC50A+细胞中高表达。ATPases是以三磷酸腺苷为能量的多级跨膜转运蛋白,是维持生命活动的重要功能蛋白[12]。目前认为,ATPases蛋白家族能够和CDC50A协同作用将磷脂由细胞外质转移到细胞双磷脂层内侧的细胞质小叶[13]。P4-ATPases家族共有14种亚型,在肿瘤的研究中发现ATP8A1与肿瘤的侵袭转移相关[14],ATP8B1和ATP11B与化疗耐药相关[15-16],ATP11C与细胞凋亡相关[17]。Hiroyuki Takatsu[18]等研究发现第5类(ATP 10A、ATP 10B 和 ATP 10D)和第 6 类(ATP 11A、ATP 11B 和 ATP 11C)P4-ATP酶需要CD 50蛋白(主要是CDC50A)才能退出内质网(ER),最终完成亚细胞定位。本课题组前期实验表明:在卵巢癌细胞系中,同时上调ATP11A、ATP11B的表达可协助增强CDC50A干细胞特性,并在一定的顺铂浓度下,可增强其耐药性。本论文在上述研究的基础上,以卵巢癌细胞系为载体,深入观察下调CDC50A表达对其干细胞特性的影响;进一步利用高通量基因组测序技术对人卵巢癌原代标本中CDC50A+及CDC50A-细胞分别行全外显子及转录组测序并对比,进一步寻找CDC50A发挥干细胞表面标记物作用的可能机制;并下调ATP11A、ATP11B的表达,研究其对CDC50A阳性细胞干性功能的影响。二、研究方法1、通过下调卵巢癌细胞系中CDC50A的表达,进一步验证其作为卵巢癌干细胞标记物特异性的改变。首先利用慢病毒包装技术,构建表达shCDC50A的慢病毒载体。采用外源基因转染技术转染293FT细胞,利用293FT细胞产生的病毒液感染SKOV3、OVCAR4细胞系。流式分选技术获稳定细胞系(SKOV3-shCDC50A、OVCAR4-shCDC50A)。经一定浓度的顺铂处理细胞后,采用CCK-8法染色,酶标仪检测不同细胞群体在OD450nm处吸光度,验证SKOV3-shCDC50A、OVCAR4-shCDC50A细胞对化疗耐药性的改变。顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡,Annexin V及DAPI染色细胞,流式细胞技术检测CDC50A下调后细胞凋亡率的改变。2、利用高通量测序技术对人卵巢癌原代标本CDC50A+、CDC50A-细胞分别进行基因测序,通过比较分析,探讨CDC50A发挥干性功能作用机制。收集2例卵巢癌患者新鲜肿瘤组织,经组织消化后分离得到卵巢癌细胞,流式细胞分选仪分选获得CDC50A+和CDC50A-细胞,微量DNA、RNA提取技术分别提取DNA和RNA,全外显子及转录组基因测序,获得两组细胞的差异表达基因并分析。3、通过下调卵巢癌细胞系中ATP 11A、ATP 11B的表达,探讨CDC50A与ATP 11A、ATP11B的相互作用机制:1)下调卵巢癌细胞系中ATP11 A、ATP11B的表达后,采用RT-PCR及western-blot技术在基因和蛋白水平验证CDC50A表达水平的改变。利用外源基因转染技术、RT-PCR及western-blot等分子技术筛选shATP11A、shATP11B质粒。利用筛选后的质粒构建低表达ATP11A、ATP11B慢病毒载体,转染293FT细胞。利用293FT细胞产生的病毒液,经外源基因感染技术感染SKOV3-CDC50A细胞,流式分选技术获稳定共表达基因组细胞系SKOV3-CDC50A-shATP11A、SKOV3-CDC50A-shATP11B。RT-PCR 及 western-Blot技术鉴定卵巢癌细胞系中稳定下调ATP 11 A、ATP 11B后CDC50A表达水平的改变。2)通过sphere形成实验及NSG小鼠成瘤实验验证稳定低表达ATP11A、ATP11B卵巢癌细胞系干性功能的改变。采用无血清悬浮培养的方法分别检测 SKOV3,SKOV3-CDC50A,SKOV3-CDC50A-shNC,SKOV3-CDC50A-shATP11A以及SKOV3-CDC50A-shATP11B等不同组间sphere的形成能力。利用已获得以上稳定细胞系建立NSG小鼠卵巢癌移植瘤模型,初步观察成瘤情况,验证ATP11A或ATP11B对CDC50A阳性细胞干性功能的影响。三、研究结果1、在SKOV3与OVCAR4等两种卵巢癌细胞系中,下调CDC50A的表达后,其相关干细胞特性明显减弱,经顺铂处理后的细胞活力明显下降、细胞凋亡明显增多。经9ug/ml的顺铂处理后,分别在24h、48h、72h等不同时间点检测两种细胞群体的细胞活力。结果发现,SKOV3-shCDC50A的细胞活性显著低于SKOV3-shNC 细胞群,24h 平均细胞活力 19.11%vs 44.51%,P=0.0178;48h,9.33%vs 35.69%,P=0.024;72h,0.26%vs 11.50%;P<0.001。OVCAR4-shCDC50A群体的细胞活性也显著低于OVCAR4-shNC,24h平均细胞活力22.33%vs 29.33%,P=0.041;48h,2.90%vs 5.93%,P=0.021;72h,0.63%vs 3.13%,P<0.001。经6ug/ml浓度顺铂处理后,SKOV3-shCDC50A群体凋亡细胞(早期凋亡+晚期凋亡)比例显著高于 SKOV3-shNC(47.92±11.43 vs 22.98±10.02,P=0.024);OVCAR4-shCDC50A群体凋亡细胞比例显著高于OVCAR4-shNC(43.95±0.778 vs 25.71±1.158,P<0.001)。2、分别收集2对人卵巢癌原代标本,流式分析分离出CDC50A+、CDC50A-细胞,对其全外显子及转录组基因进行测序。结果表明,CDC50A+和CDC50A-细胞在外显子水平上并无明显差异。在转录组水平上:CDC50A+和CDC50A-细胞共有1617个蛋白编码基因表达有显著差异(FDR<0.1)。差异表达的基因(Degs)显著集中(q值=0.0229)在磷脂转运ATP酶活性的基因本体(GO)的分子功能(MF)类别上;在23个具有磷脂转运ATP酶活性的基因中有7个基因表达存在差异显著,包括 ATP11A、ATP11B、ATP8B2、ATP8B4、ATP10A、ABCA1 和ABCA7。3、卵巢癌细胞系中ATP11A、ATP11B的表达下调后,CDC50A在基因及蛋白水平表达也明显下降、sphere形成能力及小鼠成瘤能力明显减弱。分别比较SKOV3-shNC,SKOV3-CDC50A,SKOV3-CDC50A-shNC,SKOV3-CDC50A-shATP11A,SKOV3-CDC50A-shATP11B 等 5 种细胞群体间的 sphere形成能力,结果发现SKOV3-CDC50A群体显著高于SKOV3-shNC(平均成球数目:18.67 vs 7.68,P=0.021),SKOV3-CDC50A-shATP1 1A 及 SKOV3-CDC50A-shATP1 1B的sphere形成能力显著低于SKOV3-CD50A-shHC(8.67vs 15,P=0.02;8.67 vs 15,P=0.021)。NSG小鼠成瘤实验表明,低表达ATP11A或ATP11B的卵巢癌细胞系的成瘤能力明显降低。5X105细胞均可使小鼠成瘤,相同时间处死小鼠,SKOV3-CDC50A-shNC组小鼠移植瘤重量明显高于SKOV3-CDC50A-shATP11A、SKOV3-CDC50A-shATP11B 组(P 值分别为 0.003、0.0028);进一步行流式分析:SKOV3-CDC50A-shNC组CDC50A+/Lin-细胞的绝对值明显高于 SKOV3-CDC50A-shATP11A、SKOV3-CDC50A-shATP11B 组(P值分别为0.037、0.032)。四、结论1、卵巢癌细胞系中下调CDC50A表达后可明显减弱卵巢癌细胞对化疗耐药等干细胞特性,进一步证明了 CDC50A是卵巢癌干细胞特异性的标记物。2、通过对CDC50A+、CDC50A-细胞的全外显子及转录组基因的测序结果分析,提示CDC50A可能通过ATP家族在代谢水平调控卵巢癌干细胞的功能。3、在卵巢癌细胞系中,下调ATP11A或ATP11B表达水平均可明显降低CDC50A表达水平,减弱CDC50A阳性细胞的卵巢癌干细胞特性,提示CDC50A阳性的卵巢癌细胞通过ATP11A或ATP11B发挥其干细胞作用。