单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM),是人兽共患病李斯特病(listeriosis)的病原菌,易感染免疫力底下者,从而导致败血症、脑膜炎、肠胃炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中,食品中存在的单增李斯特菌对人类的安全具有危险。自上个世纪80年代以来,发掘新的李斯特菌毒力因子以及探索外界环境对毒力因子的调控一直是人们关注的热点。因此,本文旨在探究(1)运用多位点序列分析MLST网站数据库的信息用于调查中国单增李斯特菌的遗传多样性和分布情况;(2)运用Illumina pair-end测序技术用于中国单增李斯特菌株流行性ST型菌株基因组分析;(3)构建一个单增李斯特菌的sigB缺失突变株用于描述σB对单增李斯特菌表形分析;(4)运用Illumina RNA-HiSeq测序技术用于探究σB因子对单增李斯特菌中基因水平的调控模式。本研究主要研究内容和研究结果如下:1.中国分离的单增李斯特菌基因组多样性和分布调查本研究运用了eBRUST和MEGA软件分析了中国分离的单增李斯特菌基因组多样性和分布情况。通过54株单增李斯特菌7个管家基因所对应的等位基因数分析,获得了单增李斯特菌在中国的分布情况和流行性;通过这些菌株的7个管家基因的核苷酸序列以及氨基酸序列分析,得到了单增李斯特菌的遗传多样性。结果表明在目前的巴斯德MLST网站数据库中,CC155是最流行的克隆群菌株,ST155是CC155的代表性菌株ST型。同时,CC155含有ST705、ST806、ST311、ST712和ST381。以核苷酸序列建立的系统进化树表明CC155与CC7、CC121、CC9和CC33属于相似度达到100%;以氨基酸序列建立的系统进化树表明CC155中各ST型之间的同源性较高,从而得出氨基酸构建的系统进化树比核苷酸更能清楚的说明菌株之间的进化性。血清型分析结果表明与CC155克隆群包含的ST型菌株均为1/2a,表明中国流行性单增李斯特菌多为可致病性菌株。因此,MLST网站分析中国单增李斯特菌可为国内预防单增李斯特菌污染情况提供了有力的证据,从而维护食品的质量安全和保障公众的身体健康。2.中国单增李斯特菌株流行性ST型菌株基因组的分析本研究运用了Illumina pair-end测序技术获得了单增李斯特菌WaX12的基因组。WaX12为本实验室分离的单增李斯特菌,血清型1/2a,ST型为155,均为中国典型的单增李斯特菌类型。通过16S rRNA系统进化树分析,确定了WaX12与Finland 1998菌株的基因组相似度最高。同时,通过MAVUE多基因组序列比对,发现WaX12与Finland 1998存在三个白色区域。再次,运用比较基因组学发现了WaX12是中国发现的第一株含5个原噬菌体的单增李斯特菌。原噬菌体1包含了毒力相关的因子lmaDCBA基因簇,这个基因簇在单增李斯特菌中常见;原噬菌体2含有普通的噬菌体结构模块,通过比对发现这些模块在大肠杆菌中常见;原噬菌体3和原噬菌体4与肠球菌属噬菌体非常相似,可以视为同一个原噬菌体,并且原噬菌体3含有Holin而原噬菌体4含有phi-80毒力因子;原噬菌体5表现出与李斯特菌病毒噬菌体A118有高度相似的组成元件和基因重排,其中含有lmaC毒力因子。而且,原噬菌体5与病毒噬菌体A118发生了基因组倒置,我们猜测病毒噬菌体A118上的attp与WaX12的attB相结合从而整合进入基因组形成原噬菌体,这也暗示着WaX12为溶原性菌株。因此,我们猜测5个原噬菌体在单增李斯特菌适应性和毒力进化上起到重要的作用,而这个新的序列数据为研究单增李斯特菌基因组变异性和进化性提供了更好的基础,并加速了单增李斯特菌流行性、抗性机理和毒性机理方面的研究3.单增李斯特菌WaX12的sigB基因缺失突变株的构建与生长动力学分析本研究利用重叠PCR与同源重组的方法建立了构建单增李斯特菌sigB基因缺失突变株的体系。普通PCR技术扩展出sigB基因两侧的上游同源臂和下游同源臂,然后运用重叠PCR(SOE-PCR)技术获得sigB缺失片段。将sigB基因缺失片段插入到穿梭载体pKSV7中,构建重组穿梭质粒pKSV7-ΔsigB。将pKSV7-ΔsigB电转到LM-WaX12的感受态细胞,通过抗生素培养基筛选和引物PCR验证,结果筛选得到可以扩增出上游臂和下游臂的合成片段847bp的阳性转化子。对阳性转化子在氯霉素压力和42℃条件下传代培养20代,并在普通培养基与含氯霉素的培养基传代筛选,获得缺失菌株WaX12-ΔsigB。通过在无氯霉素压力的37℃条件下传代培养20代,利用sigB基因的两侧引物PCR验证后验证缺失菌株,确定该菌株为sigB基因的缺失菌株并且可以稳定遗传。通过Baranyi模型揭示了σB因子对LM应对环境反应过程中起到了重要的作用,得出在pH5的盐酸环境下,WaX12-△sigB和WaX12的最大比生长速率μmax、延滞期λ与最大细菌浓度MPD-OD均存在显著性差异,为下一步研究σB对LM在酸性环境下对毒力基因以及生长情况的调控作用,提供了重要的分子理论依据。4.WaX12-△sigB和WaX12比较转录组学的分析本研究利用了Illumina RNA-HiSeq测序技术分析了WaX12-△sigB和WaX12在稳定期的比较转录组学,揭示了σB因子对各功能基因和表达水平。结果表明WaX12含有3,048个功能基因,σB因子调控140个基因。其中正调控的123个基因和负调控的17个基因。这些基因包括了毒力因子、能量因子、环境压力因子和膜蛋白。同时,果糖和甘露糖代谢是受σB因子显著性调控最多的代谢通路(p<0.05)。为了保证调控基因的可信性,本研究利用了相对荧光定量PCR验证了7个受σB因子显著性调控的基因。结果表明,RNA-seq测序结果与荧光定量PCR验证基本一致。转录组学的比较对研究单增李斯特菌在外界环境下基因水平的调控机制提供了生物信息学基础。