抗变异链球菌卵黄抗体对变异链球菌抑制作用的研究

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目的变异链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)是龋病的主要病原体之一,卵黄抗体(immunoglobulin of yolk,IgY)是禽类经特异性抗原刺激,由B淋巴细胞产生,并移至卵黄中的抗体,制备并纯化抗变异链球菌卵黄抗体(抗S.mutans-IgY),测定不同浓度S.mutans-IgY对变异链球菌的OD值、胞外多糖、葡糖基转移酶活性、生物膜形成及活性的影响。研究抗S.mutans-IgY的的抑菌机制,为卵黄抗体防龋特性提供更有利的理论依据。抗S.mutans-IgY作为稳定、安全、无耐药性等特点的新型药物,为临床防治龋病提供新的思路。方法将甲醛灭活的S.mutans免疫150日龄白航蛋鸡4次,每次间隔10d,取鸡蛋用两步硫酸铵沉淀法提取IgY,ELISA检测免疫后效价变化,采用BCA法测提纯后的抗S.mutans-IgY浓度。在不同浓度卵黄抗体中培养变异链球菌,分别于培养0h、3 h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h、27h时,利用紫外分光光度计,选取630 nm波长并测定各时间段的细菌OD值,并绘制生长抑制曲线图。蒽酮法测定水不溶性及水溶性胞外多糖、Neson-Somogyi法测定GTF酶活性,采用扫描电镜观察牙菌斑生物膜形态;XTT还原比色法研究IgY对生物膜总量的影响;采用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察牙菌斑生物膜厚度以及死菌和活菌的构成比的变化。所有的实验数据均采用SPSS 16.0统计软件进行分析。结果ELISA检测抗S.mutans-IgY的效价为1:256000,并保持40d,BCA法测得提纯后IgY,经换算1g卵黄经两步硫铵沉淀纯化后可得总IgY约13mg。随着IgY浓度的增加,24 h细菌OD值呈下降趋势,4 mg/L和8 mg/LIgY组生长曲线平缓且低伏。IgY对S.mutans合成水不溶性胞外多糖的能力较对照组有明显抑制,且差异有统计学意义;IgY作用后S.mutans还原糖、酶活力均降低,且差异有统计学意义;扫描电镜观察24h后的牙菌斑生物膜,细菌之间的交联紧密,密集交联成网状结构;XTT法结果显示IgY对S.mutans生物膜抑制率为17.02%~74.13%;CLSM观察到随着药液浓度增加,绿色的活菌、团块结构减少,生物膜厚度明显减少。结论抗S.mutans-IgY能够有效地抑制变异链球菌的生长、致龋毒力因子及菌斑生物膜的活性,一定浓度IgY能够抑制S.mutans的增殖,具有抗龋作用。
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