目前,促黄体生成素(LH)的检测主要分为定性检测和定量检测。定性检测多采用胶体金免疫层析法,肉眼即可判读,操作简单,但灵敏度低只适用于初筛。定量检测有主要有放射免疫检测法、酶联免疫吸附法、化学发光免疫法、时间分辨荧光免疫分析技术等。其中,放射免疫检测法存在放射性核素污染、标记物的货架期短等问题,临床上使用频率低。酶联免疫吸附法耗时长、操作复杂,且酶的大分子标记容易影响被标记物的空间结构,限制了检测的灵敏度。化学发光法是目前临床上应用比较多的检测方法,其灵敏度高,特异性好,但耗时长,对检测仪器有较高的要求。时间分辨荧光免疫分析技术与其他定量检测方法相比,无污染、灵敏度高且对设备没有太高要求,但以微孔板为反应载体,需要洗涤分离结合标记与游离标记,操作过程步骤多、周期长、样品消耗大、不易自动化,难以广泛应用于生物医学研究和临床医学检验。本论文结合时间分辨荧光免疫分析技术和层析技术的优点,采用双抗体夹心法,将偶联时间分辨荧光微球后的抗体固化在玻纤上,建立一种新型的固相时间分辨免疫层析法,并用于定量检测促黄体生成素(LH)。相对于传统的液相时间分辨免疫层析法(即偶联时间分辨荧光微球后的抗体保存于样本稀释液中),该法灵敏度更高,读数时间更短、与高浓度同源性激素临床样本交叉反应更低,且试剂的稳定性更好,保存期限长,成本低廉,结果准确、检测便捷。经多轮实际试用,已证明其适合大规模临床应用。方法将LH单克隆抗体(检测抗体)和羊抗鸡IgY(质控抗体)标记铕离子荧光微球后处理在结合垫上;另一株LH单克隆抗体(包被抗体)包被于硝酸纤维素膜的检测线T位置;鸡IgY抗体包被在硝酸纤维素膜质控线C位置,将包被好的底片材料、荧光结合垫和样品垫组装成免疫层析试剂条,建立时间分辨荧光免疫层析方法。血清中的LH与标记了 Eu-CM的LH检测抗体特异性结合,形成抗原抗体反应复合物,该反应复合物沿着硝酸纤维素膜前移,在硝酸纤维素膜T位置形成包被抗体-LH-检测抗体-Eu-CM复合物,在C线位置形成鸡IgY-山羊抗鸡IgY-Eu-CM复合物,使用免疫荧光检测仪检测T、C位置的荧光信号并计算比值(T/C),通过标准曲线计算得出LH血清样本的浓度。从LH抗体的性能、荧光结合垫处理溶液配方及工艺、样品垫的配方及抗体包被配方等几个方面进行研究和优化。在最佳的实验条件下,通过最低检出限、线性范围、精密度、准确度、特异性、稳定性等方面对所建方法进行性能评价。收集常规检测LH可信度较高的化学发光法(CLIA)检测标本后,再用所建方法重复检测,验证方法的可靠性。结果本研究建立了一种基于时间分辨荧光免疫分析技术和层析技术相结合的促黄体生成素(LH)免疫层析检测方法并制成试剂盒,该方法检测促黄体生成素(LH)的最低检出限为0.165mIU/mL,检测范围0.5-200mIU/mL,与同源高浓度性激素人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺素(TSH)无交叉反应,稳定性好,常温下可保存2年。同雅培全自动化学发光分析系统相比,两种检测方法间的线性相关系数为0.9874(n=120),两种方法学具有高度的相关性。而本方法检测时间更短,仅需15分钟(化学发光法要30分钟),采用的荧光免疫分析仪体积更小,成本更低,使用更为简便、广泛。临床试用结果已证明其在灵敏度,读数时间、特异性、保存期限等方面拥有较大大的优势,且成本低廉,结果准确、检测便捷,已有商品化试生产。综上所述,本研究为临床检测血清中促黄体生成素(LH)提供一种快速、准确的免疫层析检测方法并制成试剂盒,各项指标(灵敏度、精密度、特异性、稳定性、准确性)均达到临床检测要求。为其他激素的临床检测提供了一种新的检测方法,具有较为广阔的应用前景。