骨髓间充质干细胞在组织生物工程和再生医学领域有着巨大的应用潜力。然而有很多问题尚未解决，比如干细胞分化的效率，种子细胞的数量以及干细胞恰当的移植方法等。对于干细胞的分化，主要诱导方法是采用基因重编码或是化学特殊诱导因子，尽管这些方法可以成功实现诱导，但是他们所引起的致瘤性及过度分化等问题一直受到研究者的关心。如果能从干细胞本身着手，大大提高干细胞的分化潜能，这将有望有效的提高干细胞的诱导效率，但是目前尚无特异性提高干细胞自身分化潜能的有效手段。在过去40年中，太空航天事业的发展让人们认识到微重力对生物有着重大的影响。其中包括脑脊液流动改变，体液电解质丧失，肌肉萎缩，免疫系统功能下降等。同样,微重力会改变细胞的一些性质，包括细胞的形态功能和细胞对环境的反应。我们的研究发现微重力干预后MSCs细胞形态发生明显变化，由长梭形转变为类圆形。―形者神之质，神者形之用‖，形态的改变必然导致其功能的变化。在中医圆道理论指导下，我们认为细胞圆形的改变正是一种原始状态的回归。圆形的骨髓间充质干细胞是否具有更高的分化潜能。本研究采用地面回转培养器（2D-clinostat）模拟细胞在空间中的受力情况，以地面正常1g重力（Normal gravity,NG）作为对照，研究模拟微重力（simulated microgravity,SMG）干预后骨髓间充质干细胞向神经细胞分化以及向内皮细胞分化的能力，同时探讨微重力通过对细胞骨架以及关键分子RhoA活性的动态调节，从而指导干细胞向不同方向分化的机制。本研究首次提出细胞形态对于干细胞诱导效率有重大意义，并依据中医―圆道‖观提出SMG刺激来提高干细胞诱导的新策略，有望实现干细胞高效率高安全性的诱导，为干细胞广泛安全的运用于临床提供新的思路。实验一模拟微重力干预促进MSCs向神经细胞分化目的：观察SMG致骨髓间充质干细胞形态、凋亡及多潜能指标的改变，并对SMG作用后MSCs向神经细胞分化效率进行评价。方法：原代培养大鼠骨髓间充质干细胞，流式细胞术进行鉴定，实验随机分为2D-clinostat干预的SMG培养组与NG对照培养组；倒置显微镜下观察细胞形态，流式细胞术分析凋亡，反转录PCR检测多潜能标志OCT4表达的变化，激光共聚焦、流式细胞术、real-time PCR观察诱导后神经样细胞MAP-2、CHAT、TH的表达，ELISA及real-time PCR检测细胞神经营养因子表达水平，同时应用膜片钳技术检测诱导后神经元动作电位变化。结果：①MSCs的培养与鉴定：所培养的MSCs细胞经流式细胞术鉴定，表达CD9097.37%和CD4494.35%，表达CD45阴性。②SMG72小时左右后细胞形态及凋亡变化：通过r值（细胞长轴和短轴的比值）反应细胞变圆程度，采用MetaMorph7.1software分析SMG组细胞明显趋于圆形（p<0.05）。流式细胞术检测未发现有凋亡。③细胞多潜能标志物OCT4表达：微重力干预24小时后OCT4的表达明显升高（p<0.05）。随着干预时间延长其表达变化不明显。④诱导的神经细胞MAP-2/CHAT/TH表达：a.PCR检测微重力干预后分化的神经样细胞表达更高MAP-2，CHAT,TH水平。对于MAP-2的表达，在分化7天和14天表达水平约是正常重力组两倍（p<0.05）；对于TH的表达，在分化14天时表达水平增高约1.5倍（p<0.05）；对于CHAT的表达，在分化7天时表达水平是正常重力组1.7倍（p<0.05）。b.流式细胞术检测表达MAP-2,CHAT,TH阳性细胞数：微重力干预组明显高于正常重力组。微重力组MAP-2阳性细胞数48.03%±2.33%，正常重力组37.22%±1.98%；微重力组TH阳性细胞数17.45%±1.26%，正常重力组14.06±1.95%；微重力组CHAT阳性细胞数5.53%±1.32%，正常重力组2.96%±1.58%。⑤神经营养因子的表达：在诱导前，微重力明显提高MSCs分泌神经营养因子的浓度。其中BDNF浓度比正常重力组增加了100%，（p<0.05）,CNTF浓度增加了85%（p<0.05）。在分化7天后，CNTF浓度比正常重力组提高了50%（p<0.05）,其他未见有明显差异。同时MSCs在分化前比分化后分泌神经营养因子浓度更高。PCR进一步证实了结果。⑥动作电位：微重力干预后MSCs分化的神经样细胞表现为更具成熟特性的动作电位特征。微重力组细胞动作电位幅度及频次明显高于正常重力组。结论：SMG作用下圆形的骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化能力更高。实验二模拟微重力干预促进MSCs向内皮细胞分化目的：对SMG作用后MSCs向内皮细胞分化效率进行评价。方法：原代培养大鼠骨髓间充质干细胞，实验随机分为2D-clinostat干预的SMG培养组与NG对照培养组；免疫荧光及反转录PCR检测诱导后细胞表达vWF、Flk-1量，采用DiI-Ac-LDL吞噬实验及体外血管成形实验的试剂盒检测两组诱导后内皮细胞的功能差异。结果：①免疫荧光检测：以分化前MSCs为空白对照，微重力干预组内皮样细胞表达vWF和Flk-1量明显高于正常重力组。分化前MSCs未见表达vWF和Flk-1。②反转录PCR:微重力干预后的MSCs分化为内皮样细胞表达vWF水平是正常重力组的2.8倍（p<0.05）；表达Flk-1水平是正常重力组的1.6倍（p<0.05）。微重力处理明显促进MSCs向内皮细胞的分化。③DiI-Ac-LDL吞噬实验：两组分化后的内皮细胞都具有摄取脂质的能力，两组间未见有明显差异。然而对于未分化的MSCs两组都未见有摄取现象。④体外血管成形实验：software Image J分析软件分析成管面积,成管长度差异。分化6天后微重力组成环面积和长度都明显高于正常重力组（p<0.05）。结论：SMG作用下圆形的骨髓间充质干细胞向内皮细胞的分化能力更高。实验三细胞骨架和RhoA共同调节微重力对MSCs分化的影响目的：观察不同时间段微重力作用对细胞骨架和RhoA活性的变化，初步探讨其影响MSCs向不同方向分化的机制。方法：原代培养大鼠骨髓间充质干细胞，实验随机分为短时间干预SMG72h组、长时间干预SMG10d组与NG对照培养组；激光共聚焦检测细胞骨架α-actin、Microtubules变化。将不同组细胞向神经方向，内皮方向、成脂方向、成骨方向诱导分化10天，反转录PCR检测不同组分化的效率。Rho GTPase pull-down Assay检测不同组RhoA的活性变化。RhoA活性阻滞剂Exoenzyme C3Transferase干预后检测MSCs分化能力的变化。结果：①鬼笔环肽对不同组MSCs细胞骨架α-actin的标记。短时间微重力处理细胞骨架张力下降，表达减低。随着时间延长，微重力处理10天后微丝表达有所恢复，骨架张力升高。②β-tubulin对不同组MSCs细胞骨架微管蛋白的标记。短时间微重力处理微管崩解，模糊不清，表达减低。随着时间延长，微重力处理10天后微管有所聚集，微管蛋白表达有所恢复。③向内皮诱导：SMG72h诱导的细胞表达vWF水平增高，是正常重力组的1.6倍（p<0.05），然而当微重力处理时间为10天后，诱导的细胞表达vWF水平明显下降。④向神经方向诱导：SMG72h诱导的细胞表达MAP-2水平增高，是正常重力组的2倍（p<0.05），SMG10天后， MAP-2水平明显下降，基本和正常重力组表达水平一致，同SMG72h组比较，差异显著（p<0.05）。⑤向成骨诱导：SMG72h ALP水平减低，约是正常重力组的0.6倍（p<0.05），然而当SMG10天后，诱导的细胞表达ALP水平明显增加，同微重力72h组比较，差异显著（p<0.05）。⑥向成脂诱导：SMG72h组表达PPARγ2水平明显增加，约是正常重力组的1.6倍（p<0.05），然而SMG10天后，诱导的细胞表达PPARγ2水平明显下降，同SMG72h组比较，差异显著（p<0.05）。⑦总RhoA表达量在干预各组没有明显变化，然而活化RhoA的表达量SMG72h组明显下降，与正常重力组相比下降约80%（p<0.05）；但是SMG10天后RhoA的活性显著回升，与72h处理组相比高出约10倍，与正常重力组相比表达水平升高约60%（p<0.05）。⑧RhoA阻滞剂干预后，SMG10d组分化的能力被逆转，成骨方向分化能力明显下降，ALP表达下降80%（p<0.05）；成脂方向分化能力增加，PPARγ2表达水平提高约3倍（p<0.05）。结论：微重力不同作用时间对细胞骨架张力的改变和微管的聚散很可能是通过RhoA调节作用。当短时间干预MSCs，降低了RhoA活性，引起细胞张力的下降，促进其向应力非敏感细胞的分化。当长时间干预MSCs,提高RhoA的活性，引起细胞张力升高，促进其向应力敏感性细胞的分化。