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目的:p14ARF基因是一细胞周期调控基因,它主要阻滞细胞于G1期和G2/M期,大量临床及实验研究发现p14ARF的变异,如其基因缺失、启动子甲基化等与恶性肿瘤的发生、发展和预后密切相关。P14ARF是p53基因的上游基因,能通过抑制MDM2对p53的降解而间接上调p53基因,组成p14(ARF)-MDM2-p53这一作用通路。P53是公认的抑癌基因,在肿瘤的发生、发展、侵袭和转移方面起重要作用。我们设想p14ARF能否通过上调p53基因,对胰腺癌PC-3细胞的生长和侵袭进行调节,同时我们还对一些与肿瘤生长和侵袭相关基因如MMP2、MMP9和VEGF,趋化因子如IL-1β、IL-8和CXCR4,以及粘附分子VCAM-1的表达进行分析,以阐明胰腺癌侵袭和转移机制,研究p14ARF基因和侵袭转移相关基因之间的关系,揭示p14ARF抑制肿瘤血管生成及侵袭和转移的内在机制,为今后p14ARF的临床基因治疗提供依据。 方法:将外源性含人野生型p14ARF cDNA全长序列的重组质粒pCI-neo-p14ARF和空载体质粒pCI-neo通过脂质体试剂Fugene 6介导分别转染入人胰腺癌PC-3细胞中,G418筛选相应的阳性克隆株PC-3/p14和PC-3/vec,经RT-PCR、Western blot法检测在PC-3/p14细胞中p14ARF基因的mRNA转录和蛋白质的翻译表达。随后将三株细胞株接种到裸鼠皮下,观察细胞在体内的生长情况。用基因芯片检测转染p14ARF基因后的PC-3细胞基因表达谱的变化。我们用Matrigel胶侵袭试验观察三株胰腺癌细胞侵袭能力的变化,并用RT-PCR和免疫组化法分析与肿瘤侵袭和转移相关的MMP2和MMP9的转录和表达情况。为进一步研究p14ARF基因对肿瘤血管生成的影响。我们用RT-PCR和Western blot法对三株细胞移植瘤VEGF的转录和蛋白表达进行分析,用免疫组化法比较三株细胞移植瘤内微血管密度(MVD)和VEGF的表达差异,最后用RT-PCR法对三种移植瘤内趋化因子IL-1β、IL-8和CXCR4,粘附分子VCAM-1的mRNA表达进行初步分析和比较。 结果:胰腺癌PC-3细胞株的p14ARF基因呈缺失变异,外源性人野生型p14ARF基因和空载体pCI-neo通过脂质体介导成功转染入PC-3细胞,经G418筛选得到阳性克