脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤之一,约占全部脑肿瘤的45～55%。目前,脑胶质瘤的治疗手段主要包括手术治疗、放射治疗、化学治疗和综合治疗等,尽管近年来上述治疗措施已取得长足进步,但由于胶质瘤呈浸润性生长,与周围脑组织无明显分界且易于复发,且疗效均不甚理想。新的治疗手段如基因治疗等虽有望成为治愈胶质瘤的途径之一,但是目前仍缺乏理想可靠的治疗靶标。因此寻找调控胶质瘤细胞恶性生物学行为的分子靶标,明确其在胶质瘤发病过程中的病理机制,已成为神经外科领域的研究热点之一。自噬相关基因(autophagy-related gene, Atg)调节的细胞自噬活性下降在肿瘤的形成中具有重要作用。Beclin 1 (Atg6)是重要的自噬调节基因,主要作用是通过与Vps34/PI3K形成复合物促进自噬, Bcl-2能与Beclin 1结合抑制自噬活性。因为Beclin 1与Bcl-2家族中抑制凋亡的蛋白结合,但不能与促凋亡蛋白结合,并且研究Beclin 1的分子结构发现其具有Bcl-2家族中促凋亡蛋白共有的BH3结构,所以Beclin1可能参与凋亡的调节。Beclin 1被认为是肿瘤抑制基因,其杂合性缺失是细胞发生恶性转化的原因之一。Beclin 1抑制肿瘤的作用可能是提高肿瘤细胞自噬活性。Yue等应用Beclin 1基因敲除小鼠的胚胎干细胞,发现Beclin 1完全缺失小鼠死于胚胎早期,Beclin 1杂合性缺失小鼠虽然表型正常,但体内细胞自噬活性降低,而且自发肿瘤发生率高。Liang等将Beclin 1稳定转染MCF-7细胞株后,发现自噬空泡的数量增加,癌细胞体外增殖能力及恶性表型下降,并且在裸鼠中肿瘤形成能力降低。实验发现化疗能引发细胞自噬性死亡,而在凋亡抑制细胞中自噬诱导剂可上调Beclin 1具有治疗作用。Beclin 1抑制肿瘤不仅诱发细胞自噬性死亡,而且能停滞细胞周期,抑制细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤坏死及炎症扩散,预防细胞基因组突变。Beclin 1基因还和一些肿瘤相关信号传导通道关系密切,如PTEN通道和Rb信号传导通道都与Beclin 1不同程度相关。因此,探讨Beclin 1参与脑胶质瘤发生发展以及恶变的分子病理机制,尤其是在细胞自噬和凋亡中的作用,有助于明确胶质瘤的恶性生物学行为及机理,有望为胶质瘤的临床治疗提供新的分子靶标。本研究拟通过观察Beclin 1在不同病理级别脑胶质瘤以及胶质瘤细胞株中的确切表达情况,并通过过表达和敲减Beclin 1在胶质瘤细胞株中的表达,研究Beclin 1在恶性胶质瘤细胞自噬尤其是凋亡方面的作用。实验共分为三个部分：第一部分,观察Beclin 1在脑星形细胞肿瘤组织中的蛋白表达水平以及与病理级别的相关性；第二部分,观察Beclin 1在U251和U87脑胶质瘤细胞株中的mRNA和蛋白表达水平及相关蛋白的表达,以及构建Beclin 1蛋白表达抑制和过表达的U87细胞株和检测相关蛋白的结合情况;第三部分,研究Beclin 1在U87细胞自噬、凋亡和增殖中的作用。第一部分Beclin 1在星形细胞肿瘤组织中的表达目的：本研究检测自噬相关基因Beclin 1在星形细胞肿瘤中的表达情况,探讨其与星形细胞肿瘤病理和临床表现的相关性及意义。方法：用免疫组化和(或)免疫印迹法检测62例不同级别的星形细胞肿瘤Beclin1蛋白表达,并结合临床和病理因素进行分析。结果：免疫组化显示Beclin 1蛋白在星形细胞肿瘤胞质中表达强弱随肿瘤级别升高而降低,在胞核中则相反。免疫印迹法检测高级别星形细胞肿瘤(Ⅲ／Ⅳ级)Beclin1平均光密度比值小于低级别肿瘤(Ⅰ／Ⅱ级,p=0.036)。LC3B-Ⅰ在不同级别的星形细胞肿瘤中表达无明显差异,但LC3B-Ⅱ在胶母细胞瘤中的平均光密度比值低于其他级别的肿瘤(p=0.030)。Beclin 1和LC3B-Ⅱ高表达者的生存率有升高趋势,两者在星形细胞肿瘤中表达正性相关(p=0.035)。结论：Beclin 1和LC3B-Ⅱ在胶母细胞瘤中的表达下调,自噬活性的改变可能与星形细胞肿瘤的发生、发展相关。第二部分Beclin 1在恶性胶质瘤细胞系中的表达目的：研究Beclin 1、Bcl-2家族蛋白和Vps34在胶质瘤细胞系U251和U87中的表达和蛋白之间的结合情况；研究Beclin 1在U87细胞株经过表达或RNA干扰后与Bcl-2家族蛋白和Vps34结合情况。方法：用脂质体法将表达Beclin 1 siRNA和Beclin 1基因质粒分别转染U87细胞株,鉴定转染效率和细胞Beclin 1蛋白表达。应用real-time PCR检测Beclin 1在胶质瘤细胞系U251和U87中的mRNA表达水平,应用免疫印迹方法研究Beclin 1、Bcl-2家族蛋白和Vps34在胶质瘤细胞系中的蛋白表达水平,应用免疫共沉淀检测]Beclin 1与Bcl-2家族蛋白和Vps34之间的结合情况。结果：Beclin 1 siRNA和Beclin 1基因表达的质粒在转染进入U87细胞后抑制和过表达效果较好。RT-PCR和免疫印迹结果提示Beclin 1 mRNA和蛋白表达水平在胶质瘤细胞系U251和U87中明显下调。免疫印迹提示Bcl-2家族蛋白在U251和U87中明显上调(P<0.05)。Beclin 1和Vps34复合物能在各处理组U87中发现；在各对照组和RNA干扰后的U87中检测免疫共沉淀未发现Beclin 1分别与Bcl-2、Bcl-xL形成复合物,而在过表达Beclin 1的U87中检测出Beclin 1分别与Bcl-2、Bcl-xL形成复合物。结论：Beclin 1在所有被检测的胶质瘤细胞系中,其mRNA和蛋白表达水平明显低于正常胶质细胞,且Bcl-2家族蛋白在U87细胞中表达增高。U87中Beclin 1与Vps34能形成复合物,在Beclin 1过表达时Beclin 1才与Bcl-2类似蛋白形成复合物。不同处理组之间Beclin 1蛋白结合变化可能是Beclin 1参与调节白噬和凋亡作用的机制。第三部分Beclin 1表达对胶质瘤细胞自噬、凋亡和增殖的作用目的：研究过表达或抑制Beclin 1对U87胶质瘤细胞株白噬、凋亡和增殖的影响;以及Beclin 1在凋亡通路中的具体作用。方法：利用第二部分中U87细胞株的不同处理组培养48小时,采用免疫印迹检测LC3、p62在各组的表达；用Hoechst 33258染色及流式细胞仪测定各组凋亡细胞比例;氚标胸腺嘧啶脱氧核苷(trituum—labelled thymidine,3H-TdR)掺入检测各组细胞增殖率。用免疫荧光和免疫印迹检测各组细胞色素C的分布和表达情况；用免疫印迹检测活性caspase3/8/9表达；用免疫荧光检测Beclinl和caspase3在细胞中的表达。结果：LC3-Ⅱ在过表达组呈高表达；在抑制组呈低表达。P62在过表达组呈低表达；抑制组呈高表达。Hoechst 33258染色及流式细胞仪测定显示过表达组凋亡细胞比例增高；其他各组无明显变化。3H-TdR法显示过表达组细胞增殖减缓,其他各组无明显变化。免疫荧光显示过表达组细胞色素C弥散分布于细胞中；其他各组细胞色素C分布比较集中且仅限于胞质。免疫印迹发现过表达组胞质中细胞色素C有表达,其他各组未见明显表达。免疫印迹检测显示过表达组活性caspase3/9表达增高,caspase8在各组间无明显差别。免疫荧光显示Beclin 1和caspase3在过表达Beclin 1的U87细胞中的表达增加,并有相关性。结论：在Beclin 1抑制组中细胞自噬活性下降,凋亡活性无明显变化,细胞增殖无明显变化。而过表达组白噬活性增强,凋亡活性增强,细胞增殖减缓。过表达组胞质中细胞色素C表达增高,caspase3/9活性增高。结合第二部分结果(Beclin 1过表达时Beclin 1才与Bcl-2类似蛋白形成复合物),我们认为Beclin 1通过与Bcl-2和Bcl-xL结合,引起细胞色素C从线粒体释放进入胞质,激活caspases3/9,从而促进细胞凋亡。