结冷胶与微生物抗菌肽的结合机理及结合物特性的研究

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微生物抗菌肽具有抗菌谱广、不容易引起细菌耐药性、易实现量产等优点,是目前较有希望替代传统抗生素的一类抗菌物质。然而,微生物抗菌肽在生物医药中的广泛应用受限于其稳定性低、功能单一、细胞毒性高等问题。结冷胶是一种水溶性和结构稳定性相对均衡、生物相容性优良的微生物多糖,在食品中已有广泛应用但在生物材料中的应用非常有限。将结冷胶与微生物抗菌肽结合可有效改善微生物抗菌肽自身存在的缺陷,本论文以三种典型微生物抗菌肽为模板,系统地研究了结冷胶与微生物抗菌肽的结合方式及结合物的生理生化活性,并实现了结合物在抗感染活性物质、神经抗炎活性物质、抗菌缝合线及内毒素吸附性血液灌流材料中的应用,对结冷胶和微生物抗菌肽在生物医药和生物材料领域中的大规模应用有着重要的研究意义。(1)通过与结冷胶的共价接枝,乳酸链球菌素对碱、热和蛋白酶的抗菌稳定性得到了有效提升。红外光谱(FT-IR)结果表明:结冷胶结构单元中的羧基和乳酸链球菌素中的游离氨基发生了酰胺化反应并形成了稳定接枝物。核磁共振结果显示:该酰胺反应主要发生在乳酸链球菌素N端;乳酸链球菌素分子的C端未被结合并且内环结构在反应过程中未被破坏。Zeta电位结果表明:接枝物能在水溶液中形成稳定团簇,该结构对乳酸链球菌素能起到缓冲和保护的作用。抗菌实验结果显示:乳酸链球菌素负载量为405.6±2.5 mg·g-1的接枝物GNc对表皮葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有显著的抑制性;GNc在p H 4~10范围内的抗菌时效性是乳酸链球菌素的两倍;GNc在弱碱性(p H7.5)环境中经热处理(60和80℃)30 min后和糜蛋白酶处理(400和800 mg·L-1)30min后仍能保留对表皮葡萄球菌的抗菌活性。对GNc的生物相容性进行评价发现:GNc对3T3细胞没有显著的细胞毒性,也没有显著的溶血性,还能有效防止表皮葡萄球菌侵染3T3细胞。(2)多粘菌素B的细胞毒性通过与结冷胶的共价接枝得到了有效降低,且相应接枝产物的神经抗炎机制也得到了初步阐明。FT-IR结果显示:结冷胶和多粘菌素B通过酰胺反应形成了新的酰胺化产物。多粘菌素B含量测定结果显示:多粘菌素B负载量为490.8±1.6 mg×g-1的接枝物(GPC)中多粘菌素B的综合利用率较高。缓释实验结果显示:GPC中的多粘菌素B能在模拟体液(SBF)中实现缓慢释放;其在平稳释放区间(60~132 h)内的平均动态释放速率为25μg×m L-1。抗菌实验显示:GPC对大肠杆菌和铜绿假单胞菌均有良好的抑制作用。进一步对GPC的生物相容性进行评价发现:GPC对BV-2细胞的半数致死浓度和增殖影响浓度分别为2048和512μg×m L-1(多粘菌素B有效含量),远高于游离多粘菌素B对BV-2细胞的半数致死浓度(16μg×m L-1)。神经抗炎结果显示:1μg×m L-1的GPC就能将内毒素激发的BV-2细胞NO的释放量控制在3μmol·L-1以下,起到神经抗炎的作用。(3)聚赖氨酸和结冷胶通过湿法纺丝过程中的原位聚合得到了机械强度良好的聚离子复合物纤维,所得纤维被成功的应用在抗菌缝合线中。对湿法纺丝过程进行单因素优化,所制得的结冷胶-聚赖氨酸纤维经纺纱、加捻和拉伸后得到了复合物纱线GPF。理化测定结果显示:GPF的拉伸强度和断裂模量分别能达到4.29±0.48 N和195.53±29.83 N×m-1。崩解实验结果表明:GPF在生理盐水中168 h内不会发生崩解,在SBF中168 h内也仅有少量崩解(残留率为83.2±1.2%)。抗菌实验结果显示:GPF对表皮葡萄球菌和大肠杆菌均有良好的抑制作用;GPF还能有效防止纱线表面生物被膜的形成。生物相容性评价结果表明:GPF对BV-2细胞没有显著的细胞毒性和溶血性。小鼠伤口缝合实验结果证实:GPF作为背部伤口缝合线的实验组小鼠伤口能在5 d内愈合,且实验小鼠在实验期内未发生感染。(4)通过湿法纺丝制得了有良好内毒素吸附性能的多粘菌素B/结冷胶-聚赖氨酸复合物纤维(PLGP)。综合考虑结冷胶的流动性及其与聚赖氨酸的结合率,最终确定多粘菌素B的体系添加量为10 mg×L-1。对PLGP纱线进行理化评价结果显示:该复合物纱线在湿润、干燥和再湿润时的拉伸强度分别为1.54±0.12、14.59±1.08和1.50±0.13 N;相应的断裂模量则分别为346.21±50.26,4738.87±571.68和333.27±53.36N×m-1。对PLGP复合纤维的内毒素吸附性能进行评价发现:异硫氰酸荧光素标记的内毒素分子能均匀的吸附于PLGP表面;PLGP在SBF和小鼠血液中对大肠杆菌内毒素的吸附率分别为2.78±0.04和2.45±0.11 EU×mg-1。进一步评价PLGP的生物相容性发现:PLGP对U2OS细胞没有显著的细胞毒性和粘附性,也没有显著的溶血性;PLGP对C57小鼠血液凝结性能没有显著性影响。血液过滤实验结果发现:PLGP织物对血细胞没有截留性,也不会导致血细胞破裂,是一种潜在的内毒素吸附性血液灌流材料。
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