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目的双酚A（Bisphenol A,BPA）是典型的环境内分泌干扰物之一,具有拟雌激素和抗雄激素的特性。巨噬细胞是先天免疫和适应性免疫中最重要的免疫细胞之一,但BPA影响巨噬细胞功能的机制尚不清楚。本研究从自噬和凋亡的角度,研究AMPK/mTOR在BPA对巨噬细胞毒作用中的潜在机制,并探讨自噬与凋亡之间的关系,为预防环境内分泌干扰物诱导的免疫毒性提供新的证据。方法以小鼠白血病巨噬细胞（RAW264.7）为靶细胞,设立对照组（Con）组,其余组均以10μg/m L LPS为激活剂,分为0、10、100、200μmol/L BPA染毒组,和mTOR抑制剂或自噬激活剂（1.25μg/m L RAPA）、自噬抑制剂（2.5 mmol/m L3-MA）、Bcl-2抑制剂（2.5μmol/L ABT-737）单独干预组,以及干预剂与100μmol/L BPA联合作用组,作用12 h。采用MTT法检测各组细胞活力;Annexin V-FITC/PI试剂盒检测细胞凋亡率;Real time PCR、Western blot法检测细胞分泌因子IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β与自噬相关指标ATG6、LC3、p62、ATG5、ATG12以及凋亡相关指标Bax、Caspase-9、Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2等的mRNA表达和蛋白表达水平;免疫荧光进一步检测ATG6、LC3、p62的荧光强度;中心红颗粒检测巨噬细胞吞噬能力;Caspase-Glo3/7（?）试剂盒检测Caspase-3或Caspase-7活性。结果1.BPA对RAW264.7细胞活力的影响与Con比较,0μmol/L BPA使细胞活力升高（P＜0.05）;与0μmol/L BPA比较,100、200μmol/L BPA组细胞活力明显降低（P＜0.05）。2.BPA对RAW264.7细胞功能的影响与Con相比,0μmol/L BPA组TNF-α和TGF-βmRNA以及0μmol/L BPA组的IL-10和TGF-β蛋白水平均升高（P＜0.05）;与0μmol/L BPA组相比,100、200μmol/L BPA组的IL-6 mRNA表达水平及10、100μmol/L BPA组的TNF-αmRNA的表达水平均升高,100、200μmol/L BPA组的IL-6和TNF-α蛋白水平均升高（P＜0.05）;而10、100、200μmol/L BPA组的IL-10 mRNA的表达水平及10、200μmol/L BPA组的TGF-βmRNA的表达水平均降低,10、100、200μmol/L BPA组的IL-10及TGF-β蛋白水平均降低（P＜0.05）;且在100、200μmol/L BPA组RAW264.7细胞吞噬能力明显降低（P＜0.05）。3.BPA对RAW264.7细胞自噬的影响与Con相比,0μmol/L BPA组的ATG6和p62 mRNA的表达水平升高（P＜0.05）;与0μmol/L BPA组相比,100、200μmol/L BPA组p62、LC3ⅡmRNA表达水平及10、100、200μmol/L BPA组的ATG5 mRNA表达水平及200μmol/L BPA组的ATG6、ATG12 mRNA的表达水平均升高（P＜0.05）;而100、200μmol/L BPA组的ATG6蛋白水平及100μmol/L BPA组的LC3Ⅱ/Ⅰ比值均降低（P＜0.05）。进一步通过免疫荧光检测发现,与Con相比,0μmol/L BPA组的ATG6和p62荧光强度减弱;与0μmol/L BPA组相比,100、200μmol/L BPA组的ATG6和200μmol/L BPA组的LC3荧光强度均减弱,而100μmol/L BPA组的p62荧光强度略增强。4.AMPK/mTOR参与BPA影响RAW264.7细胞自噬与Con相比,0μmol/L BPA组的AMPK和mTOR mRNA的表达水平均下降（P＜0.05）;与0μmol/L BPA组相比,100μmol/L BPA组的p-AMPK/AMPK蛋白水平降低,100、200μmol/L BPA组p-mTOR/mTOR蛋白水平均升高（P＜0.05）;与100μmol/L BPA组相比,100μmol/L BPA+1.25μg/m L RAPA组的p-AMPK/AMPK、ATG6和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白水平均升高,而100μmol/L BPA+1.25μg/m L RAPA组的p-mTOR/mTOR蛋白水平降低（P＜0.05）;免疫荧光检测发现,与100μmol/L BPA组相比,100μmol/L BPA+1.25μg/m L RAPA组的ATG6和LC3荧光强度均增强,而p62荧光强度减弱。5.AMPK/mTOR参与BPA影响RAW264.7细胞功能与Con相比,0μmol/L BPA组的IL-10和TGF-β蛋白水平升高（P＜0.05）;与0μmol/L BPA组相比,100μmol/L BPA组的IL-6和TNF-α蛋白水平均升高,而100μmol/L BPA组的IL-10和TGF-β蛋白水平均降低（P＜0.05）;与100μmol/L BPA组相比,100μmol/L BPA+1.25μg/m L RAPA、1.25μg/m L RAPA组的IL-6和TNF-α蛋白水平均降低,而100μmol/L BPA+1.25μg/m L RAPA组的IL-10和TGF-β蛋白水平均升高（P＜0.05）;此外,与100μmol/L BPA比较,100μmol/L BPA+1.25μg/m L RAPA、1.25μg/m L RAPA组的RAW264.7细胞吞噬能力均增加,而100μmol/L BPA+2.5 mmol/m L 3-MA、2.5 mmol/m L 3-MA组的RAW264.7细胞吞噬能力进一步降低（P＜0.05）。6.BPA对RAW264.7细胞凋亡水平的影响与Con相比,0μmol/L BPA组Caspase-8 mRNA的表达水平升高,而0μmol/L BPA组的Bcl-2 mRNA表达水平降低（P＜0.05）;与0μmol/L BPA组相比,100、200μmol/L BPA组RAW264.7细胞凋亡率明显增加（P＜0.05）;10、100、200μmol/L BPA组的Bax、Caspase-3和Caspase-9 mRNA的表达水平及200μmol/L BPA组的Bcl-2 mRNA的表达水平均升高;而10μmol/L BPA组降低Bcl-2 mRNA的表达水平（P＜0.05）。7.自噬对RAW264.7细胞凋亡的影响与Con比较,0μmol/L BPA使细胞活力升高（P＜0.05）;与0μmol/L BPA比较,100μmol/L BPA组的细胞活力降低（P＜0.05）;与100μmol/L BPA比较,100μmol/L BPA+1.25μg/m L RAPA、1.25μg/m L RAPA组的RAW264.7细胞活力均增加,而100μmol/L BPA+2.5 mmol/m L 3-MA、2.5 mmol/m L 3-MA组的RAW264.7细胞活力进一步降低（P＜0.05）。与Con相比,0μmol/L BPA组的Bax/Bcl-2比值降低（P＜0.05）;与0μmol/L BPA组相比,100和200mol/L BPA组的Bax/Bcl-2比值和Caspase-3/7活性均升高（P＜0.05）;与100μmol/L BPA组相比,100μmol/L BPA+1.25μg/m L RAPA组的Bax/Bcl-2比值降低,而100μmol/L BPA+2.5 mmol/m L3-MA的Bax/Bcl-2比值进一步升高（P＜0.05）;此外,与100μmol/L BPA组相比,100μmol/L BPA+1.25μg/m L RAPA、100μmol/L BPA+2.5 mmol/m L 3-MA、2.5mmol/m L 3-MA组的Caspase-3/7活性均升高（P＜0.05）。8.Bcl-2抑制剂ABT-737对RAW264.7细胞ATG6的影响与0μmol/L BPA比较,当ABT-737浓度超过2.5μmol/L使RAW264.7细胞活力显著降低（P＜0.05）;与100μmol/L BPA比较,100μmol/L BPA+2.5μmol/L ABT-737组的RAW264.7细胞活力均降低（P＜0.05）。与100μmol/L BPA比较,100μmol/L BPA+2.5μmol/L ABT-737、2.5μmol/L ABT-737组的ATG6 mRNA水平和蛋白水平均升高,而100μmol/L BPA+2.5μmol/L ABT-737、2.5μmol/L ABT-737组的Bcl-2蛋白水平均降低（P＜0.05）。9.BPA对RAW264.7细胞雌激素受体的影响与Con比较,0μmol/L BPA组的ERαmRNA表达水平降低（P＜0.05）;与0μmol/L BPA比较,200μmol/L BPA组的ERαmRNA水平和蛋白水平均升高（P＜0.05）。结论1.BPA诱导RAW264.7细胞分泌促炎因子,抑制分泌抗炎因子,并降低细胞吞噬能力。2.自噬和凋亡参与调控BPA对RAW264.7细胞的毒作用。3.BPA通过AMPK/mTOR信号通路抑制细胞自噬,并通过内源性线粒体通路诱导细胞凋亡。4.Bcl-2和ATG6参与了BPA调控细胞凋亡和自噬的过程。