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传染性法氏囊病是一种高度接触性传染病,引起禽类严重的免疫抑制和法氏囊损伤,它最早于1957在美国甘布罗镇发现,又称甘布罗病。其病原体传染性法氏囊病病毒,属于双RNA病毒科;含有两个血清型,但只有一型对鸡有致病性。该病毒无囊膜,只有一层外壳,表达5种蛋白,即VP1,VP2,VP3,VP4,VP5;其中VP2是主要的宿主保护性抗原,并组成外衣壳。传染性法氏囊病病毒作为双股RNA病毒的一员,与双股RNA病毒科,呼肠孤病毒科的许多成员具有一定的相似性。不少双股RNA病毒的受体得到了鉴定:如轮状病毒受体主要包括唾液酸、整合素家族、热应激同源蛋白70、Toll-like受体、组织血型抗原等,其通过与该病毒的不同蛋白相互作用,从而达到感染不同组织和细胞;呼肠孤病毒利用结合黏附分子A(junctional adhesion molecule A),Nogo等作为受体,利用GM2多糖,唾液酸等作为辅受体,共同协助病毒与宿主细胞作用,造成病毒感染和复制。传染性法氏囊病病毒经过众多学者的研究。目前已经分离到不少受体:如表面免疫球蛋白M,整合素,膜联蛋白A2,鸡热休克蛋白90等四种受体;但是他们是基于不同的细胞产生的受体,表面免疫球蛋白M是从鸡的B成淋巴细胞系LSCC-BK3中找到的,鸡的Hsp90是从DF-1细胞发现的,整合素是通过验证BALB/c 3T3细胞系得来的,鸡的膜联蛋白A2则是从DF-1细胞的VOPBA实验中捕获到的。从IBDV发现至今已经经历了几十年,从弱毒株到强毒株,从野毒株到细胞适应毒株等等,使得不同毒株对一些相同或者不同的细胞产生了不同的感染能力,可能因此受体也具有了多样性。1.稳定表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的DF-1细胞系的构建本研究首先构建pcDNA-VP2真核表达质粒,然后通过脂质体转染的方法,将其转染进DF-1细胞系,利用细胞分裂过程中染色体的同源重组,将质粒中的传染性法氏囊病病毒的VP2基因重组插入DF-1细胞中,在药物zeocin的筛选下,构建成一个稳定表达VP2蛋白的细胞系。通过一系列研究,最终确定zeocin的工作浓度为25μg/ml为最佳筛选浓度;将细胞系不断培养传代,至60代对所构建的细胞系进行形态学,细胞生长曲线,间接免疫荧光,聚合酶链式反应(PCR),免疫印迹等各种方法进行了分析鉴定,发现所构建的细胞系生长状态良好,形态保留原有DF-1细胞系梭状特征,只是略肥大;通过检测和比较其生长曲线发现,在抗性药物维持下,细胞生长分化速度低于正常的DF-1细胞和无抗性药物维持的细胞;利用单克隆抗体2H11做间接免疫荧光试验发现传染性法氏囊病病毒的VP2蛋白在构建的pcDNA-VP2 DF-1细胞系中得到了充分表达;通过提取细胞系中的基因组并进行PCR检测,发现了 VP2目的基因的存在;Western-blot实验证实了 VP2蛋白在细胞系中得到了表达。这一系列实验表明pcDNA-VP2 DF-1细胞系构建成功,其中的目的蛋白VP2得到了稳定表达。这个细胞系为下一步实验提供了重要的实验材料和物质基础。2.传染性法氏囊病病毒在DF-1细胞上受体的分离鉴定通过提取pcDNA-VP2 DF-1细胞系和DF-1细胞系(对照)的细胞膜蛋白与纯化的单克隆抗体2H11及protein A+G agrose相互作用,进行免疫共沉淀,再将沉淀产物进行SDS-PAGE电泳和银染,找出差异蛋白条带;另外,将pcDNA-VP2 DF-1细胞系和DF-1细胞系(对照)进行充分裂解,取裂解蛋白上清与纯化的单克隆抗体2H11及protein A+G agrose相互作用,免疫共沉淀,SDS-PAGE电泳,银染,通过比较切取差异蛋白。将两种方法的差异蛋白合并,进行质谱分析。质谱结果得到近50种差异蛋白,然后将这50种蛋白进行分类,并分析各个蛋白的功能,特别对其能否作为受体参与病毒的感染复制进行了深入分析,最后通过比较筛选,认定HSC70和波形蛋白(vimentin)为疑似受体,这为下一步受体的鉴定和验证奠定了基础。3.HSC70和波形蛋白(vimentin)疑似受体的验证实验及相关分析(1):利用HSC70的抗体封闭DF-1细胞,然后进行病毒阻断实验,考察疑似受体得到封闭阻断后,对传染性法氏囊病病毒的感染复制的影响。实验过程如下:预先将生长状态良好的DF-1细胞用HSC70抗体孵育,通过抗体中和封闭HSC70疑似受体,然后感染IBDV的细胞适应毒,48小时后通过观察细胞病变,间接免疫荧光实验,荧光定量PCR实验,Western-blot实验,取上清测定TCID50等,通过与阳性对照比较发现,随抗体浓度增加,抑制病毒的效果增强。主要表现为细胞病变减少,细胞中病毒蛋白表达量减少,病毒的基因表达水平下降,病毒滴度同样下降明显。(2):通过HSC70抑制剂VER-155008作用于DF-1细胞,然后进行病毒感染抑制实验,本实验主要考察热休克蛋白70特异性抑制剂VER-155008对HSC70抑制后,对IBDV的感染复制的影响。实验步骤如下:首先将DF-1细胞用抑制剂孵育6小时,然后加入:IBDV细胞适应毒感染细胞,在24小时,48小时,72小时不同时间段取上清测TCID50及免疫印迹实验,在与阳性对照比较中发现,由于实验组细胞在抑制剂作用后,细胞上HSC70受到大量抑制,导致不同时间段细胞中病毒滴度显著下降,细胞中病毒蛋白的表达也同步降低。(3):通过波形蛋白(vimentin)抑制剂丙烯酰胺作用于DF-1细胞,然后感染传染性法氏囊病病毒进行病毒抑制实验。实验步骤如上:将DF-1细胞预先用丙烯酰胺孵育2小时,然后加入IBDV细胞适应毒感染细胞,在24小时,48小时,72小时不同时间段取上清测病毒滴度并进行免疫印迹实验。同阳性对照组比较发现,实验组在丙烯酰胺作用后,其病毒复制能力下降明显,细胞中病毒蛋白的表达水平也显著降低。4.HSC70和波形蛋白受体重建实验通过RT-PCR扩增出HSC70及波形蛋白的基因,然后将它们分别克隆进真核表达载体pcDNA3.1空载体,然后再将构建的真核表达质粒pcDNA-HSC70和pcDNA-vimentin转染IBDV非易感细胞MDCK细胞,48小时后,用MOI=5的IBDV感染细胞,7天后,取其上清及细胞裂解液测TCID50,感染正常的DF-1细胞进行间接免疫荧光实验,结果发现TCID50为0,间接免疫荧光为阴性。表面看起来受体重建失败,但经过查阅相关文献发现,HSC70体外表达能产生天然免疫,其介导分泌的I型干扰素具有抗病毒作用;而波形蛋白能形成“笼子”状结构,过表达的蛋白会将病毒隔离包围起来,阻止其进一步进入细胞内。