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阿卡波糖（Acarbose）作为一种α-葡萄糖苷酶抑制剂,被广泛用于临床治疗2型糖尿病,近年来,随着全球糖尿病患病率的不断增长,阿卡波糖的市场需求量逐年上升。工业上,该化合物主要是通过游动放线菌的衍生高产菌株Actinoplanes sp.SE50/110发酵产生。前期研究者们利用蛋白序列同源性分析、化合物同位素标记喂养及体外酶学分析等手段,提出了阿卡波糖生物合成途径的假说,即:以景天庚酮糖-7-磷酸为前体合成的C7-环醇单元与以D-葡萄糖-1-磷酸为前体合成的双脱氧糖单元经糖基转移酶催化缩合形成dTDP-阿卡维基-7-磷酸核心,然后再与一分子的麦芽糖缩合生成阿卡波糖-7-磷酸,而后,该化合物脱去磷酸生成阿卡波糖。但是,除了C7-环醇模块合成的前三步反应外,其它的反应途径均未得到证实。本研究利用蛋白同源性分析,推测了acbA、acbB和acbV基因编码的蛋白可能负责合成阿卡波糖的双脱氧糖单元。通过体内同框缺失及回补acbA、acbB和acbV基因,确定了这三个基因均为阿卡波糖合成的必需基因;而后,通过体外酶促反应,确定了相关酶的功能并测定了酶动力学参数。其中,AcbA蛋白为D-葡萄糖-胸腺嘧啶转移酶,可催化D-葡萄糖-1-磷酸和dTTP生成dTDP-D-葡萄糖,对D-葡萄糖-1-磷酸的Km值和Vmax分别为0.185±0.053 mM和2.366±0.217μmol/（min·mg）;对dTTP的Km值和Vmax分别为4.964±1.089 mM和60.310±5.419μmol/（min·mg）。AcbB蛋白为dTDP-D-葡萄糖-4,6-脱水酶,可催化dTDP-D-葡萄糖发生脱水反应生成dTDP-4-酮基-6-脱氧-D-葡萄糖,其Km值为0.353±0.089 mM、Vmax为306.401±28.740μmol/（min·mg）。AcbV蛋白为氨基转移酶,可催化dTDP-4-酮基-6-脱氧-D-葡萄糖生成dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖。其Km值为1.411±0.293 mM、Vmax为3.447±0.279μmol/（min·mg）。此外,为了能大量获得双脱氧糖模块的终产物—dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖,用于后续的研究,我们利用AcbA和AcbB蛋白的同工蛋白RfbA和RfbB（大肠杆菌来源）以及AcbV蛋白的同工蛋白GerB（Streptomyces sp.KCTC 0041BP来源）,完成了双脱氧糖模块的体外重构。最终,体外由D-葡萄糖-1-磷酸和dTTP合成dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖的效率达到49.78%。针对C7-环醇模块生物合成过程,本研究从该模块合成的中间体—有效烯醇-7-磷酸出发,通过体外酶促反应证实了AcbU蛋白不是有效烯醇-7-磷酸激酶,而是具有磷酸酶的功能,能将有效烯醇-7-磷酸和1-表-有效烯醇-7-磷酸去磷酸化。此外,利用cell-free酶促反应体系发现有效烯醇-7-磷酸可被AcbR和一个或多个未知蛋白转化为GDP-有效烯醇,并通过蛋白体外活性追踪的方法证实未知蛋白为磷酸葡萄糖变位酶（PgmA）,最终确定了在C7-环醇模块合成过程中,有效烯醇-7-磷酸可被PgmA和AcbR转化为GDP-有效烯醇。为了确定阿卡波糖合成基因簇中的必需基因,本研究在SE50/110中分别缺失了acbQ和acbK基因,发现缺失acbQ基因后,菌株丧失了阿卡波糖的合成能力,进而,通过回补实验确定了该基因为阿卡波糖生物合成的必需基因。而acbK基因缺失后,阿卡波糖的产量和生物量没有明显地变化,说明其为非必需基因。综上所述,本研究以基因的体内功能研究为基础,结合体外酶促反应,解析了阿卡波糖中C7-环醇和双脱氧糖模块的生物合成,为代谢工程提高阿卡波糖产量提供了重要的理论依据。