顺铂是一类应用十分广泛且治疗效果显著的广谱抗肿瘤药物,但其副作用极强。有研究表明铂类抗癌药物会引起多器官的严重损伤,其中最为显著的副作用是强烈的肾脏毒性。顺铂会造成严重的急性肾脏损伤(Acute kidney Inj ury, AKI),主要原因是顺铂会直接导致肾小管上皮细胞的损伤,甚至凋亡。近年来,医学界提出了最新的干细胞疗法治疗AKI,但由于伦理要求和安全因素等诸多限制,临床研究多选用成体干细胞中的间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)进行相关研究。已有研究证实MSC可以修复顺铂造成的急性肾损伤,其原理为MSC对肾小管上皮细胞具有保护作用,进一步的研究推测MSC的治疗作用主要源于细胞融合和旁分泌两种机制。以往MSC多分离纯化自骨髓,由于骨髓采自病人的髂骨,手术过程繁琐且给患者带来一定的疼痛；再者,骨髓的质量受一定限制,如患者的年龄、身体状况等。本研究选择了现今研究较少,但十分有潜力的脂肪来源问充质干细胞(Adipose-derived MSCs, AD-MSCs)作为研究对象。该细胞具有来源广泛、获取简易、增殖分化能力远高于骨髓来源MSC、质量不受患者身体状况限制等诸多优点。本研究中,人体来源的5-10ml脂肪组织经过分离、纯化、扩增后回输给动物模型。45只Sprague-Dawley雄性大鼠被分为三组：健康组、对照组(以顺铂腹腔注射AKI造模,24h后尾静脉注射生理盐水1ml/只)以及治疗组(顺铂腹腔造模24h后进行AD-MSC的尾静脉注射,注射细胞量为1-2×106细胞/1ml/只,细胞以荧光染料PKH-26进行染色示踪)。实验期间,每隔24h取大鼠尾静脉血及尿液,检测血清及尿液中的生化指标,包括血清尿素氮(BUN)、肌酐清除率(Ccr)、尿液微量白蛋白(mALB)以及β2微球蛋白(β2mG)。顺铂注射5天后,大鼠被断颈处理,取肾组织切片而后进行HE及PAS染色观察；应用TUNEL及PCNA染色检测AD-MSC对肾脏组织细胞凋亡及增殖能力的影响；并以免疫荧光染色对AD-MSCs进行示踪。细胞实验中以顺铂诱导肾小管上皮细胞系NRK-52E进行体外AKI造模,为避免细胞直接接触,我们用Transwell小室共培养顺铂诱导后的NRK-52E及AD-MSC,并分为三组,即空白组,对照组和共培养组。共培养4天后,裂解细胞提取蛋白进行western blot检测凋亡相关蛋白表达。最后,我们以胚胎干细胞作为体外模式细胞,设计并构建出一个“万能”基因打靶质粒,该质粒利用同源重组原理,将修复AKI的功能性基因打靶到细胞ROSA26染色体的上,并应用Cre/LoxP系统来实现条件打靶。PCR、免疫荧光染色和western blot检测了基因打靶后模型蛋白A的表达量和表达效果。结果显示,AD-MSC注射对顺铂诱导的AKI大鼠肾脏组织结构和功能均有十分明显的修复作用,但免疫荧光染色进行细胞示踪,发现在修复后的肾脏组织中基本无法检测到AD-MSC;随后的体外共培养实验发现,顺铂造成损伤后的NRK-52E细胞在Transwell小室隔离下与AD-MSC共培养后,与对照组相比细胞凋亡相关蛋白p38及BAX表达被明显抑制,而Bcl-2表达上调。实验数据表明AD-MSC无论是体内或者体外实验,均显示出对顺铂诱导的AKI极强的恢复作用。体内实验中,注射细胞后的大鼠肾组织内只能观察到极为少量的AD-MSC,结合体外实验推测AD-MSC对AKI的治疗作用来源于AD-MSC在受损肾小管上皮细胞的信号刺激下,产生的功能性细胞因子蛋白促进了肾小管上皮细胞的增殖,并且抑制了肾小管细胞的凋亡。尽管AD-MSC对受损的肾脏结构、功能均有一定的修复作用,并且对损伤的肾小管上皮细胞有抑制凋亡的作用,但体内体外实验中均发现,AD-MSC并不能使受损的肾脏功能恢复到完全健康的水品。,故在本研究第三部分,我们设计了“万能”基因打靶质粒,DNA及蛋白水平的检测发现,模型蛋白被插入到该质粒后,成功的同源重组到胚胎干细胞ROSA26靶位点,且重组效率高,在Cre蛋白的存在下表达效果十分明显。这一基因打靶质粒和技术将进一步优化改善,应用到AD-MSC的修饰上,将使AD-MSC可以稳定过表达关键蛋白,使AD-MSC对AKI的治疗效果提升。