多形性胶质母细胞瘤(GlioblastomaMultiforme,GBM)是神经系统中最常见的脑内原发性恶性肿瘤。胶质瘤在体内呈浸润性生长,并且恶性程度高,临床表现复杂、患者预后差。传统临床治疗方案主要是以手术为主,以及放疗、化疗或放化疗结合的综合化治疗。然而胶质瘤患者难以被治愈,患者中位生存期不超过1.5年,无论早期诊治还是预后都较为棘手。其中肿瘤细胞的异常活化和迁移侵袭的能力,是导致患者死亡的主要原因。因此找到能够抑制胶质瘤细胞的生长、增殖、凋亡、迁移、侵袭等生理特性的靶向药物对寻求有效的治疗手段有重要意义。随着分子生物学研究的快速发展,分子靶向治疗法已经越来越多的用于临床治疗恶性肿瘤中,成为一种新的治疗方法。分子靶向药物进入体内后可以高特异性地选择致癌靶标,并且高亲和力地与其结合,从而破坏其结构功能或是直接杀死肿瘤细胞,而不会损害周围其他正常的组织细胞,具有靶向性强、稳定性好、毒性小等特点。胶质瘤病人的共同特性是存在人表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的表达增高和突变。EGFR编码的蛋白质属Ⅰ型跨膜受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTKs),在膜信息转换中起重要作用,在多种人类恶性肿瘤中高表达,且与肿瘤恶性程度相关。然而EGFR表达也见于正常组织,限制了以EGFR为靶标的抗肿瘤治疗。现已发现EGFR的突变体有EGFRvⅠ、EGFRvⅡ、EGFRvⅢ型。其中最常见的突变体是 EGFRvⅢ。EGFRvⅢ是一个截短的EGFR,不受配体结合的调控便可持续产生相当于EGF的信号而被激活,完成信号转导。有研究证明其表达变化与胶质瘤的恶化及放、化疗抗性有密切关系;在其它恶性肿瘤如非小细胞肺癌、大肠癌、结肠癌等中均存在不同程度的EGFR及EGFRvⅢ的高表达。并且EGFRvⅢ仅在肿瘤组织中表达,因此EGFR及其突变体可以作为肿瘤治疗的主要靶标。适配子(aptamer)是一种生物小分子单链核酸,是从人工体外合成的大容量随机寡核苷酸文库中通过指数富集配基的系统进化技术(Systematic Evolution ofLigands by EXponential enrichment,SELEX)技术筛选和富集获得的。适配子能够以高亲和力特异性结合靶分子,并且具有精确识别、无免疫原性、易体外合成与修饰等优点。由于能够与靶分子紧密且特异地结合,适配子被人们看作一种体外合成的“抗体”,其特性甚至优于抗体。与抗体相比,适配子的优势在于:(1)核酸适配子体积小,结构稳定;(2)核酸适配子无免疫原性和毒性;(3)核酸适配子的靶物质多并且结合亲和力高,特异性强;(4)核酸适配子易于体外合成和修饰,可短期内批量生产,重复性好。因此适配子用于胶质瘤的治疗具有良好的应用前景。本课题使用的细胞是U87MG、U87-EGFRwt和U87-EGFRvⅢ人恶性胶质瘤细胞系,其中U87-EGFRwt和U87-EGFRvⅢ细胞是能分别稳定表达EGFRwt、EGFRvⅢ蛋白的U87MG细胞株。本课题前期工作是利用链霉亲和素磁珠法分离ssDNA文库,以通过cell-SELEX技术筛选得到能够与U87-EGFRvⅢ细胞高特异高亲和力的适配子U2,解离常数(Kd)值为6.27±1.40nM。为探索适配子U2与U87-EGFRvⅢ细胞的特异结合能力与抑瘤作用,本文展开了以下三方面的研究:第一部分通过流式细胞仪与共聚焦显微镜来观察与检测适配子U2与U87-EGFRvⅢ细胞的结合情况,证明了适配子U2能够与U87-EGFRvⅢ细胞高亲和力特异性结合;第二部分是通过CCK8实验、划痕实验、transwell迁移与侵袭小室实验、双染法凋亡等实验,探究适配子U2对U87-EGFRvⅢ细胞的生长、增殖、凋亡、迁移、侵袭等作用;第三部分是探究适配子U2对U87-EGFRvⅢ细胞的可能的作用机制。首先,为了观察与检测适配子U2与U87-EGFRvⅢ细胞的结合情况,将5’端标记的 1μM FAM-U2 及 1μM 原库 FAM-GN 分别和 U87-EGFRvⅢ、U87MG和U87-EGFRwt细胞孵育24h,用流式细胞仪检测各组的结合情况。结果表明适配子FAM-U2和U87-EGFRvⅢ细胞有特异性的结合,对比FAM-GN处理组细胞(相对结合率7.4%±3.4646),加入适配子FAM-U2的U87-EGFRvⅢ细胞的荧光峰值发生明显了右移(相对结合率为94.0333%±0.1764)(P<0.001)。加入适配子FAM-U2后U87MG细胞和U87-EGFRwt细胞的荧光峰值相比于原库FAM-GN组并没有发生明显变化(P>0.01)。这个结果提示适配子U2能够与U87-EGFRvⅢ细胞特异性结合。为进一步观察适配子U2可特异结合U87-EGFRvⅢ细胞,本研究将FAM-U2与U87-EGFRvⅢ细胞在常温下孵育后,用红色荧光染料标记细胞表面EGFR抗体,用蓝色荧光染料DAPI标记细胞核,在共聚焦显微镜下观察荧光标记的适配子与细胞的结合情况,结果显示U87-EGFRvⅢ细胞表面可观察到较强红色荧光即EGFRvⅢ蛋白。共聚焦显微镜观察到的绿色荧光为带有绿色荧光标记的FAM-U2,孵育5min后U87-EGFRvⅢ细胞膜上则可以观察到较强的荧光,并且与EGFRvⅢ分布有重合。孵育20min后,绿色荧光标记的更加强烈,并且分布于细胞膜与细胞质中。这说明带有荧光标记的适配子FAM-U2对靶细胞U87-EGFRvⅢ细胞有特异性结合,并且可能通过内吞等机制进入细胞。为了探究适配子U2对U87-EGFRvⅢ细胞的生理特性的影响,我们检测了在转染浓度为50nM U2后U87-EGFRvⅢ细胞的形态学变化。与对照U87MG细胞相比,适配子U2处理组U87-EGFRvⅢ细胞后细胞间隙变宽,排列松散,出现细胞凋亡现象。适配子U2处理组与对照组与GN原库处理组比较,其细胞总数大量减少,并且出现细胞皱缩并体积变小,细胞变圆、出现凋亡小体,发生了典型的细胞凋亡现象。为进一步探究适配子U2对U87-EGFRvⅢ细胞的生长、增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响,我们分别进行了 CCK8实验、迁移侵袭能力检测和凋亡检测实验。其中CCK8实验检测采用0、25nM、50nM的适配子U2分别处理24h或48h后对U87-EGFRvⅢ、U87MG、U87-EGFRwt对细胞存活率的影响。计算公式为相对存活率=(实验组OD值-空白组OD值)/(阴性对照组OD值-空白组OD值)×100%。结果显示U87-EGFRvⅢ细胞随着加入适配子U2的浓度逐渐提高,其细胞存活率逐渐降低,并且随着处理时间的延长,效应更加显著。处理48h后25nM U2实验组的U87-EGFRvⅢ细胞相对存活率为59.9360%±2.2423,50nM U2实验组的U87-EGFRvⅢ细胞相对存活率为51.8643%±3.3743,其中U2处理差异均具有统计学意义(P<0.001)。这说明适配子对U87-EGFRvⅢ细胞的增殖具有较强的抑制作用,且呈剂量和时间依赖性。但适配子U2对U87MG和U87EGFRwt细胞的作用与药物浓度和作用时间没有明显的相关性。结果提示适配子U2能够特异性抑制U87-EGFRvⅢ细胞的增殖。其次我们用流式细胞仪检测适配子U2对胶质瘤细胞U87-EGFRvⅢ凋亡的影响。Annexin V-FITC/PI双染法检测结果显示:在50nM U2处理48h后,U87MG细胞和U87EGFRwt细胞的细胞凋亡率并无明显变化,而U87-EGFRvⅢ细胞与对照组相比凋亡细胞明显增多,凋亡率为50.55%±1.5804,差异有统计学意义(P<0.001),U87MG细胞和U87-EGFRwt细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。实验结果提示适配子U2能够特异性促进U87-EGFRvⅢ细胞的凋亡。适配子U2对U87-EGFRvⅢ细胞迁移和侵袭能力分别用细胞划痕实验(Wound Healing)和transwell小室实验来检测。划痕实验是在细胞长到融合成单层状态时,在融合的单层细胞上人为划线制造一个空白区域,称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使划痕愈合,通过计算划痕面积结果对比细胞的相对迁移能力。实验开始时划痕的愈合程度为0,结果显示在划线8h后,U87-EGFRvⅢ细胞的U2处理组划痕愈合相对面积11.548%±1.6400,U87MG细胞U2处理组划痕愈合相对面积21.171%±3.5290,差异具有统计学意义(P=0.048)。在划线处理24h后,U87-EGFRvⅢ细胞的U2处理组划痕愈合相对面积为21.2%±±1.7760,明显少于U87MG细胞(划痕愈合相对面积为71.515%±1.8280),差异具有统计学意义(P<0.01),实验结果提示U2可以特异性抑制胶质瘤细胞U87-EGFRvⅢ的迁移能力。Transwell迁移实验结果显示:以GN处理后穿过transwell小室基底膜的细胞单个视野的细胞数目为基准,将实验组穿过transwell小室的基底膜并贴在膜底面的细胞数与之对比可得到迁移细胞百分数。50nM U2处理细胞24h后,U87-EGFRvⅢ细胞的迁移细胞百分数为41.94%±3.0000,而U87MG细胞迁移细胞百分数为93.917%±3.4010。在U2作用48h后U87-EGFRvⅢ细胞的迁移细胞百分数为34%±3.0000,而U87MG细胞的迁移细胞百分数为96.946%±6.4100。U87-EGFRvⅢ细胞的GN处理组与U2处理组细胞的迁移能力之间均存在显著差异(P<0.001),而GN组与U2组处理U87MG细胞在24h或48h后的迁移能力均无明显差异(P>0.05)。以上结果提示U2能够抑制胶质瘤U87-EGFRvⅢ细胞的迁移能力。我们用加入Matrigel基质胶的tranwell小室进行胶质瘤的侵袭实验。Matrigel基质胶是从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取出来的可溶性基底膜制备物。在室温条件下,Matrigel聚合形成具有生物学活性的三维基质,可以模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能,可用于对细胞迁移、侵袭等的研究。用Matrigel基质胶铺满transwell小室基底膜,可以有效检测细胞侵袭的能力。实验结果显示:以GN处理后穿过transwell小室基底膜的细胞单个视野的细胞数目为基准,将实验组穿过transwell小室的Matrigel基质胶后贴在膜底面的细胞数与之对比即可得到侵袭细胞百分数。50nM U2处理24h后U87-EGFRvⅢ细胞的侵袭细胞百分数为38.9222%±2.2670,U87MG细胞的侵袭细胞百分数为103.3079%±2.8028。U2处理48h后U87-EGFRvⅢ的侵袭细胞百分数为36.1027%±0.5160,而U87MG细胞组侵袭细胞百分数为96.206%±4.0890。U87-EGFRvⅢ细胞GN处理组与U2处理组细胞的侵袭细胞百分数均存在显著差异(P<0.001),而U87MG的GN组与U2组细胞处理24h以及48h后的侵袭细胞百分数无明显差异(P>0.05)。以上结果提示适配子U2能够特异性抑制U87-EGFRvⅢ细胞的侵袭能力。最后,我们探索U2是否能够通过影响U87-EGFRvⅢ的自磷酸化,来影响EGFRvⅢ的激活机制以及下游信号通路。为了最小化EGFR的磷酸化程度,在适配子处理前,先将U87-EGFRvⅢ细胞饥饿处理6h(2%血清培养基),在此条件下,Western blotting实验检测到EGFRvⅢ能够大量磷酸化,但是pEGFRwt几乎检测不到。结果显示适配子U2处理6h后,EGFRvⅢ的表达量基本不变,然而pEGFRvⅢ明显减少,而GN组EGFRvⅢ和pEGFRvⅢ的含量都基本不变。下游信号分子胞外信号激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)的磷酸化产物pERK在U2处理后表达量显著下降,结果提示U2可能对EGFRvⅢ信号通路具有抑制作用。综上所述,适配子U2可特异结合U87-EGFRvⅢ细胞,并且能够影响其增殖、迁移、侵袭以及凋亡等作用,其可能的作用机制还需要进一步探索。本研究为胶质瘤靶向治疗药物的开发提供了研究基础,为胶质瘤的诊断和治疗提供了新的方法和思路。