喉癌(laryngeal carcinoma)是常见的头颈部恶性肿瘤,其主要的病理类型为鳞状细胞癌。近年来,喉癌的发病率明显增加,吸烟、饮酒、环境因素、放射线、病毒感染以及微量元素的缺乏,常常通过多种途径、多个阶段以及多种分子因素的综合作用,而导致喉癌的发生。目前,喉癌主要的治疗方案仍以手术治疗和放射治疗为主,其他还有化疗、免疫治疗、基因治疗、中医治疗等综合措施。喉癌的有效治疗应是：最大程度的根除肿瘤,保全喉的功能,保证患者的生存率,同时提高生存质量。近年来随着各地诊疗水平的提高,电子喉镜检查以及早期局部活检,可使喉癌患者的生存率得到较大的提高。即便如此,仍有许多患者预后不佳,手术复发和远处转移时有发生。因此,探寻安全、有效、毒副作用小的治疗道路,依旧任重而道远。恶性肿瘤细胞最大的特点是正常生长调控系统对其失去控制,能不断地分裂与增殖,具有“不死性”。因此,对肿瘤治疗的重点是抑制其增殖,促进其死亡。肿瘤的发生常涉及多个抑癌基因的突变、磷酸化或失活。将正常肿瘤抑制基因导入肿瘤细胞以替代失去功能的基因,从而可以达到逆转其恶性表型、抑制肿瘤生长,甚至消灭肿瘤的目的,是肿瘤基因治疗的热点。p16基因是人体内重要的肿瘤抑制基因,该基因的突变和缺失与包括头颈癌在内的多种肿瘤密切相关,恢复野生型p16蛋白的功能成为抗肿瘤基因治疗研究的重要途径。P16蛋白是一种周期依赖性蛋白激酶抑制剂,直接或间接调控细胞周期,使细胞周期停滞于G1期,而且它还具有促进肿瘤细胞凋亡的作用。因此本课题将研究p16蛋白对人喉癌细胞系Hep-2生长的影响,并从细胞凋亡和细胞周期两个方面进行机制探讨。自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)是天然免疫系统的重要组成部分,无需预先致敏即可识别和杀伤靶细胞,是机体抗肿瘤免疫防御的第一道防线。由于NK细胞的杀伤活性受到细胞表面受体和细胞因子等多种分子的调控,在机体免疫系统中发挥抗肿瘤作用。而同时,肿瘤细胞可通过表达免疫抑制因子或表面配体等途经反过来调节或抑制NK细胞的功能,负性调节机体的抗肿瘤免疫应答,从而造成免疫逃逸的环境。近年来,已有证据表明导入p16基因的肿瘤细胞其细胞表面分子的表达和细胞因子的分泌都会发生一定的改变,这可能有助于改变肿瘤细胞的免疫逃逸状态。因此,本研究还将初步探讨Hep-2细胞的p16蛋白导入与机体NK细胞抗肿瘤作用之间的关系,为p16作为肿瘤治疗靶点的应用提供更为详实的理论依据。研究目的1.扩增携带野生型p16基因的重组腺病毒载体,并导入人喉癌细胞Hep-2中,观察p16蛋白的表达情况。2.观察表达野生型p16蛋白的人喉癌Hep-2细胞的增殖情况,并从细胞凋亡和细胞周期两方面探讨其作用机制。3.初步探讨表达野生型p16的人喉癌Hep-2细胞对NK细胞杀伤敏感性的变化,同时观察该细胞对NK细胞杀伤活性的调控作用。研究方法第一部分重组腺病毒载体的扩增及其感染喉癌细胞Hep-2后p16蛋白的表达情况利用人胚肾细胞系HEK-293扩增携带野生型p16基因的重组腺病毒载体；采用293细胞空斑试验测定重组腺病毒的滴度；重组腺病毒感染Hep-2细胞后,采用流式细胞术和Western blot法检测p16蛋白的表达情况。第二部分野生型p16蛋白对人喉癌细胞Hep-2体外生长和体内生长的影响采用CCK8法检测p16蛋白对Hep-2细胞增殖的影响；流式细胞仪检测p16蛋白对Hep-2细胞凋亡率和细胞周期的影响；采用电子显微镜观察细胞凋亡的形态；采用Q-PCR法检测相关细胞凋亡蛋白和细胞周期蛋白的基因表达情况；Hep-2细胞接种于裸鼠背部皮下,采用重组腺病毒瘤内注射的方式观察p16蛋白体内抑瘤作用；采用Tunnel法检测瘤体组织的细胞凋亡情况。第三部分野生型p16蛋白对人喉癌细胞Hep-2与NK细胞之间相互作用的影响采用CCK8法检测p16导入后喉癌Hep-2细胞对NK细胞杀伤敏感性的情况；流式细胞术检测p16导入后Hep-2细胞表面NK活化受体配体的表达情况；qRT-PCR检测p16导入后Hep-2细胞IL-6、IFN-γ、IL-10和TGF-β的基因表达情况；ELISA检测p16导入后Hep-2培养上清中TGF-β的分泌情况；p16蛋白导入后Hep-2细胞培养上清孵育NKL细胞,CCK8法检测该NKL对Hep-2细胞的杀伤情况；采用添加或阻断的TGF-β方式,确认Hep-2细胞培养上清的TGF-β是否参与了对NK细胞杀伤功能的调节作用。研究结果第一部分重组腺病毒载体的扩增及其感染人喉癌细胞Hep-2后p16蛋白的表达情况1.利用HEK-293细胞扩增重组腺病毒载体后,采用293细胞空斑试验测定重组腺病毒的滴度,Ad-p16的滴度为6.5×1010, Ad-LacZ的滴度为4.8×1010。2.流式细胞仪检测p16蛋白表达的结果显示,Ad-p16组Hep-2细胞感染重组腺病毒3h、6h、12h和24h时p16蛋白的表达率分别为29.5%、85.0%、92.7%和95.4%。未感染Ad-p16组的Hep-2细胞中无p16蛋白表达。3. Western blot检测结果也显示Ad-p16感染的Hep-2有明显p16蛋白的表达。第二部分野生型p16蛋白对人喉癌细胞Hep-2体外生长和体内生长的影响1.Hep-2细胞感染重组腺病毒24h,48h,72h,96h后,Ad-p16组Hep-2细胞的增殖抑制率分别为3.003%±0.497(24h),12.031%±1.946(48h)、24.857%±1.473(72h)和30.35%±1.916(96h),与Ad-LacZ比较,均有显著性差异；2.流式细胞术检测细胞凋亡率,Ad-p16组Hep-2细胞凋亡率从24h的9.99%增加到26.98%(48h)和37.87%(72h),在Ad-LacZ组和Ad-p16组之间进行比较,细胞凋亡诱导率24h时无统计学差异,但48h和72h有明显的统计学差异；3.电子显微镜下观察发现Ad-p16感染的细胞染色质浓缩和明显的凋亡小体。而Ad-LacZ感染的Hep-2细胞少见染色质浓缩和凋亡小体。4.与Ad-LacZ比较,Ad-p16感染Hep-2细胞后24h,使其G0/G1期细胞明显增加(48.36%),S期细胞明显减少(38.26%),而G2/M期细胞无明显变化；5.与Ad-LacZ组比较,促凋亡基因p53、Caspase-8和Bak在Ad-p16组的表达上调,抑凋亡基因Survivin和bcl-2的表达下调,均具有明显的统计学差异,而Bcl-xl的表达无统计学差异；6.与Ad-LacZ组相比较,细胞周期蛋白p21和cyclinDl基因在Ad-p16组的表达上调,有明显的统计学差异,而E2F2和CDK4基因的表达无统计学差异；7.裸鼠移植瘤实验结果显示untreated组及Ad-LacZ组小鼠肿瘤生长迅速,且体积与时间呈一定线性关系,两组在各时间点瘤体体积对比,均无统计学差异。与Ad-LacZ组比较,Ad-p16治疗组的肿瘤体积在12天前均无统计差异,但16天开始,肿瘤生长缓慢,具有统计学差异,且24天出现肿瘤生长消退的趋势；8.喉癌Hep-2细胞移植瘤组织Tunnel染色结果显示,untreated组Tunnel阳性细胞百分率为30.56%±1.842, Ad-LacZ组为34.44%±2.572,Ad-p16组为71.78%±3.244,可见Ad-p16组肿瘤组织的凋亡程度明显增高,与Ad-LacZ组比较,p<0.0001。第三部分野生型p16蛋白对人喉癌细胞Hep-2与NK细胞之间相互作用的影响1.用CCK8法检测NK细胞对Hep-2细胞的杀伤率,结果显示,与Ad-LacZ组对比,不同效靶比的条件下,NK细胞对Ad-p16组Hep-2细胞的杀伤效率均有不同程度的提高,且具有统计学差异；2.流式细胞术检测结果显示,Ad-p16组Hep-2细胞表面NK细胞活化性受体NKG2D的配体MICA/B和ULBP2的表达均上调,与Ad-LacZ比较,均具有显著的统计学差异；3.采用qRT-PCR检测结果显示,表达p16的Hep-2细胞可下调IL-10、TGF-β和IL-6的基因表达,上调IFN-γ的基因表达,与Ad-LacZ比较,均具有显著的统计学差异；4. ELISA检测结果显示,Ad-p16组培养上清中TGF-p的浓度低于另外两组,且具有明显的统计学差异；5.用不同组Hep-2培养上清孵育NKL细胞后,按照效／靶比4：1的比例,利用CCK8法检测NKL的杀伤活性。结果显示,单纯Hep-2细胞培养上清孵育后的NKL细胞杀伤Hep-2细胞的效率为44.80%±1.277,Ad-LacZ处理组的为44.43%±1.241,二者之间无统计学差异。而Ad-p16组的为77.10%±1.850,与Ad-LacZ组比较,p<0.0001。6. Ad-LacZ组培养上清添加anti-TGF-β Ab以阻断TGF-β的作用,结果显示,阻断后NK细胞的杀伤活性由44.43%±1.241增加到58.33%±1.525,且具有统计学差异。Ad-p16组培养上清补充TGF-β蛋白,结果显示,补充后NK细胞的杀伤活性由77.10%±1.850减少到58.73%±2.554,且具有统计学差异。研究结论1.人喉癌细胞系Hep-2细胞缺失p16蛋白的表达,而重组腺病毒Ad-p16感染Hep-2细胞后,p16蛋白在该细胞的表达率可高达95%左右,补充了Hep-2细胞缺失的p16蛋白,重组腺病毒Ad-p16可为下一步的实验研究提供良好的物质基础。2.野生型p16蛋白在Hep-2细胞的表达可使该细胞体内外的生长均受到抑制；野生型p16蛋白可使Hep-2细胞停滞于G0/G1期,减少细胞进入S期,说明p16蛋白可通过调控细胞周期来发挥其抑瘤作用；野生型p16蛋白可促进Hep-2细胞的凋亡,且呈时间依赖性；电子显微镜显示存在经典的细胞凋亡形态；移植瘤组织‘Tunnel染色也显示p16蛋白可促进细胞的凋亡,表明p16蛋白促进肿瘤细胞凋亡是其发挥抑瘤作用的另一机制。3.野生型p16蛋白在Hep-2细胞的表达,一方面,引起Hep-2细胞高表达NKG2D配体,使其对NK细胞的杀伤敏感性增加；另一方面,Hep-2细胞中细胞因子的表达发生改变,如下调TGF-β和IL-10,上调IFN-γ,进一步实验证实p16蛋白引发的TGF-β的下调可使NK细胞的杀伤活性得到提高。研究意义通过本课题的研究,初步揭示了在p16蛋白抗肿瘤机制中,存在着两条不同的作用通路,即抑制肿瘤细胞自身的生长速度和促进NK细胞对肿瘤细胞的杀伤。对这两条途径的关系,国内外鲜有研究,尚属于初步探讨,不过相信随着免疫学和基因治疗的发展,对于抑瘤基因的抗肿瘤机制的认识会越来越深入,将为肿瘤的免疫治疗开辟新的道路。