研究背景成熟的关节软骨无血液供应、神经支配及淋巴回流，故软骨的自身修复能力非常有限。直径超过3mm的关节软骨缺损将由纤维组织填充，而非透明软骨组织，不具有天然透明软骨的生物化学和生物力学特征,通常会在生理负荷下发生退变，进而造成关节功能障碍甚至丧失，成为导致肢体残废和劳动能力丧失的主要原因之一。关节软骨缺损在临床十分常见，据统计在美国每年有25万—50万的软骨损伤病人需要治疗，而现有技术存在明显缺陷：关节清理术仅能暂时缓解临床症状，不能阻止病程发展；关节融合术、关节切除成形术会使关节功能严重丧失；目前较为盛行的人工关节置换术也只是一种替代性手术，存在远期骨溶解和假体松动等问题，且费用昂贵，难以普遍采用。1984年瑞典医学家Peterson等首次报道自体软骨细胞移植技术（ACT）修复兔关节软骨缺损，术后16周检测证实关节软骨缺损被透明软骨修复。1987年瑞典歌德堡医疗中心Brittberg等报道采用该技术成功治疗人关节软骨缺损，这为随后深入开展的软骨组织工程创造了有利条件。研究者们始终在努力寻找理想的种子细胞：自体软骨细胞采集时会对捐献部位造成损伤，采集量有限，体外培养扩增费用昂贵，扩增后的细胞极易丧失原有表型且需通过二次手术才能完成治疗；异体软骨细胞的供体量也非常有限，存在免疫排斥反应和传染疾病的风险；坯胎干细胞具有全能性和无限增殖的能力，但如何有效地诱导其向软骨细胞分化，避免致瘤性，如何应对伦理学问题阻碍了其应用；成体干细胞，特别是骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有多项分化潜能，来源相对充足，获取方法简便易行，有可能成为关节软骨组织工程理想的种子细胞来源。然而，迄今为止，我们仍然无法获取纯化的干细胞，也不能精确控制其分化方向。支架的选择同样也困扰着研究者。无论是天然材料、人工合成材料、复合材料还是基因活化材料均有其局限性。随着研究的进展，天然来源的水凝胶越来越受到关注。Silverman等将纤维蛋白凝胶复合猪软骨细胞，注射到裸鼠皮下，通过组织学检查及糖胺聚糖、DNA和Ⅱ型胶原含量分析显示，在6、12周形成的固体软骨较仅注射软骨细胞或纤维蛋白凝胶的对照组有显著差异。Chung等研究表明HA水凝胶不仅可以维持体外或体内培养的软骨细胞的活力及表型，而且可以诱导MSCs向成软骨细胞分化。作为种子细胞的载体，水凝胶具有很多优势，如保持接种细胞的高度均匀性，类似活组织的水合微环境，在体内易于成胶及塑形等；同时天然成分具有良好的生物相容性，材料表面的活性基团可以促进细胞的增殖、分化，在体内易于降解且降解产物无毒性。体外实验已证实，作为关节软骨主要组成成分的Ⅱ型胶原可诱导牛MSCs成软骨分化，并且较Ⅰ型胶原组表现出更好的细胞形态和成软骨的基因表达。但Ⅱ型胶原水凝胶的制备目前尚无统一的标准，体内实验结果也有较大差异，尤其是大动物的体内实验鲜有报道。我国在组织工程软骨方面的研究取得过举世瞩目的成果，如1997年曹谊林等在裸鼠背上成功培养出具有人耳轮廓的组织工程软骨，近年来的基础研究也紧跟国际先进水平，但在成果转化和临床应用方面与国外先进水平还有较大差距。从ACT到MACI，国外已有大量的软骨损伤病人从中获益，但国内目前尚无自主研发的组织工程软骨应用于临床治疗，同时也缺乏相应的行业应用标准。第三军医大学西南医院关节外科中心从1997年开始对组织工程软骨及相关领域进行研究与开发，提出了组织工程软骨的仿生构建理念，在BMSCs的分离、纯化、培养及鉴定，关节软骨组织结构的量化研究，骨软骨连接界面等方面积累了丰富的经验。本研究旨在开发一种制备Ⅱ型胶原水凝胶的方法，在检测其生物安全性的基础上，与种子细胞复合构建成为可注射型组织工程软骨，用以修复大动物（小型猪）关节软骨全层缺损，验证该策略的修复效果。本研究采用骨髓有核细胞及骨髓间充质干细胞作为种子细胞，通过动物实验对比研究两种细胞的再生修复效果，探讨一种更为安全、经济、简便并易于向临床推广的关节软骨缺损的修复方法。研究方法1．以新鲜猪关节软骨为原料，通过冻干、粉碎、盐酸胍去除蛋白多糖、胃蛋白酶消化、氯化钠盐析、超纯水透析以及离心浓缩等一系列步骤分离、提纯Ⅱ型胶原蛋白，并制成温敏性水凝胶。对提取的Ⅱ型胶原蛋白进行氨基酸成分分析，对制备的水凝胶进行大体、组织学观察，并初步测试其胶凝化特性和生物相容性。2．以新西兰大白兔为实验动物，分离、培养BMSCs与Ⅱ型胶原水凝胶支架复合，装载于由半透膜制成的扩散盒中，无菌手术下放置于兔膝关节腔中，初步观察Ⅱ型胶原水凝胶-兔BMSCs复合物（可注射型组织工程软骨）的体内成软骨情况。3．以贵州小香猪为实验动物，无菌手术下于膝关节股骨滑车关节面造成直径6mm的全层软骨缺损。20头12月龄贵州小香猪，随机分为4组，每组10膝，A组为空白对照组，B组为单纯Ⅱ型胶原水凝胶组，C组为Ⅱ型胶原水凝胶复合BMSCs组，D组为Ⅱ型胶原水凝胶复合BNCs组；术后4周、8周取材，分别进行MRI、大体、体式显微镜、组织学观察及O’Driscoll组织学评分对各分组修复效果进行评价。研究结果1．建立了以猪关节软骨为原料的Ⅱ型胶原水凝胶提取、制备技术。制备的水凝胶支架具有良好的生物相容性和温敏性胶凝化特性——在37℃条件下5-10min转变为凝胶状。2．自制扩散盒包裹可注射型组织工程软骨，无菌手术下置入兔膝关节腔中。术后4周MRI示兔关节腔无明显积液，扩散盒完整无破损；术后8周取材观察，伤口愈合良好、无畸形，关节腔少量清亮积液、滑膜无明显充血和增生，扩散盒中的组织工程软骨可见明显的成软骨反应，颜色灰白呈半透明状；组织学观察有大量GAGs表达，细胞形态类似软骨细胞并形成多量软骨陷窝。3．成功建立贵州小香猪膝关节软骨全层缺损模型和可注射型组织工程软骨植入技术。术后8周大体观察实验组缺损处为软骨样组织所修复，空白对照组和单纯胶原组修复不完全；体式显微镜观察实验组修复组织表面平整，骨软骨连接界面及修复组织和邻近软骨界面整合满意；组织学证实修复组织为透明软骨样组织；O’Driscoll组织学评分实验组明显优于空白对照组和单纯胶原组，BMSCs组和BNCs组之间无明显差异。研究结论1．建立了Ⅱ型胶原水凝胶提取、制备技术，制备的水凝胶具有良好的生物相容性和温敏性胶凝化特性。2．建立了种子细胞（BMSCs和BNCs）分离、纯化及培养技术，并与Ⅱ型胶原水凝胶复合构建可注射型组织工程软骨，其细胞密度为105-6/ml。3．自制扩散盒包裹可注射型组织工程软骨，兔关节腔内培养8周，初步证实该组织工程软骨具有良好的成软骨能力，为下一步大动物在体修复实验提供了依据。4．建立小型猪麻醉、手术和复苏技术，成功构建了猪膝关节软骨全层缺损模型，为组织工程软骨动物实验研究提供了良好的评价载体。5．Ⅱ型胶原水凝胶复合BMSCs或BNCs构建的可注射型组织工程软骨植入体内可修复直径为6mm的贵州小香猪膝关节全层软骨缺损，修复组织为透明软骨样组织，并与周围界面整合良好。术后8周两组修复效果无明显差异（O’Driscoll评分值分别为18±0.70711和17.8±0.83666，P=0.984），均明显好于空白对照组和单纯Ⅱ型胶原水凝胶组（P<0.01）。