药物中的挥发性成分的分析测定常需采用一定的样品前处理方法进行萃取、分离、纯化、富集后再利用色谱法测定,以减少干扰成分及对色谱系统的损害等。传统的萃取纯化方法有液液萃取,如挥发油提取器提取法、水蒸气蒸馏萃取法、超声法和索氏提取法等,但这些方法均存在使用大量有机溶剂,提取时间长,提取效率低,操作步骤繁杂,暴露机会较多,易造成挥发成分的损失,使样品的信息失真等缺点。近年来,固相萃取及固相微萃取技术虽然已用于药物中的挥发性成分的含量测定,但其萃取装置的萃取头涂层种类少,价格昂贵,且使用寿命短,多次使用还存在交叉污染的问题。因此,需建立简单快速、密闭准确、选择性高、环境友好的样品前处理方法用于分析检测药物中的挥发性成分。近年来顶空技术凭借其装置简单,成本低,气体进样,对色谱系统污染少,且分析速度快,灵敏度高等特点越来越多地应用于药物中有机溶剂残留的分析检测。顶空气相色谱法(HS-GC)中顶空溶剂的合理选择是关键,一个合适的顶空溶剂首先要溶解药物及待测成分,其次要有理想的顶空效率,即灵敏度要高。水是最传统的顶空溶剂,也是水溶性药物最理想的顶空溶剂,因此,本文首先建立了以水为顶空溶剂的HS-GC分析检测藿香正气口服液中乙醇的残留量的方法,这是因为药物藿香正气口服液及待测溶剂乙醇均易溶于水,且水作为顶空溶剂无污染,也避免了使用其他高沸点的顶空溶剂如N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)等时由于在顶空时挥发产生极大的溶剂峰干扰待测组分的测定。该方法简单、准确、灵敏,既减少了对待测物的干扰,又不污染色谱系统,适用于藿香正气口服液中乙醇残留的含量测定。虽然水是理想的顶空溶剂,因其对水不溶性待测组分具有憎水作用而表现出良好的顶空效率。针对水不溶性的药物和待测组分,虽然可以使用的其他的高沸点的传统顶空溶剂DMF、DMSO等,但它们在顶空时随待测组分一起挥发,不仅会产生宽大的色谱峰干扰检测,其加热时也不稳定会分解产生挥发性杂质,因而检测需扣除“溶剂空白”,既麻烦又易引入误差。如果解决了水不溶性药物及待测组分在水中的溶解分散问题,水这一理想的顶空溶剂会在很多药物的挥发性的分析检测中得到应用。本文采用以水为顶空溶剂加入少量改性剂—甲醇的方法,建立了分析检测百草油中薄荷脑和水杨酸甲酯含量的HS-GC,改性剂充分溶解药物基质后再加入水中能使药物迅速分散在水中,同时甲醇在顶空溶剂中所占比例很少,进入色谱柱的量相对较小,而且甲醇保留时间也较短,不干扰测定,适用于罗浮山百草油的质量控制。在水中加入少量改性剂的方法虽然解决了待测组分的溶解分散问题,但仍存在的缺点是少量的改性剂—甲醇易挥发略影响待测组分的顶空效率,通过综合考虑顶空溶剂对药物及待测成分的溶解性及顶空效率,我们建立了以0.1%的聚山梨酯80水溶液为顶空溶剂的HS-GC分析检测萘敏维滴眼液中薄荷醇含量的方法,表面活性剂—聚山梨酯80的加入,既增大薄荷醇在水中的溶解度,又保证了较高的顶空效率,灵敏度高,而且聚山梨酯80不挥发,不干扰检测,0.1%的聚山梨酯80水溶液有望成为分析检测脂溶性药物及待测挥发性成分的理想顶空溶剂。近年来,离子液体作为一种新型溶剂,凭借其非挥发性和高溶解性的特点已成为顶空溶剂的研究热点,本课题组已在以往的研究中采用多种离子液体作为顶空溶剂的HS-GC分析检测了药物中的有机溶剂残留,但目前离子液体的种类繁多,致使人们在应用时面对庞大的离子液体家族无从选择,主要停留在“尝试-比较-筛选”的阶段,这不仅会造成时间、精力及成本的浪费,而且不能达到最佳的理想效果。但离子液体在HS-GC的理论研究缺乏,特别是其对某些有机溶剂的顶空分配行为的研究方面缺少理论指导,因此本文研究了三种离子液体作为顶空溶剂对八种醇类有机溶剂的分配行为,初步建立了顶空分配系数与溶剂的物理性质相互关联的数学模型,为以后HS-GC分析检测有机溶剂时选择合适的离子液体提高方法的灵敏度提供了理论基础。该方法可以扩展到更多的离子液体和有机溶剂,通过进一步优化模型的参数,逐渐揭示离子液体对待测溶剂的顶空分配规律,以此指导正确合理的选用离子液体。该部分研究正在进行中。通过对传统溶剂水的改性行为的研究,解决了待测药物及组分的溶解分散问题,又保证了顶空效率,建立了HS-GC分析检测药物中各种挥发性成分含量的方法,避免了传统方法的诸多不足,但仍存在一些缺点,如待测组分仅通过与顶空溶剂分配后即进样检测,限制了灵敏度的提高。为进一步提高方法的灵敏度,我们尝试建立顶空单滴微萃取(HS-SDME)的方法分析检测药物中的挥发性成分,这样待测组分经过二次分配与富集,灵敏度更高,更适合分析检测成分复杂的药物中的挥发性成分。该法集挥发性成分的分离、纯化与富集为一体,既可以减少干扰成分,又避免了对后续色谱检测系统的污染,是简便、快速和灵敏的样品前处理新技术。因此本文在已建立了分析检测百草油中薄荷脑和水杨酸甲酯含量的HS-GC的基础上,仍通过考察优化HS-SDME的萃取条件,建立了以DMF为萃取溶液的HS-SDME-GC分析测定了百草油中的二主成分的含量,该法避免了传统方法的诸多不足,操作简单,分析成本低,在密闭容器中仅5 min即完成了萃取纯化过程,分析速度快,且灵敏度更高。HS-SDME虽然优点多但也存在一些缺点,例如萃取的溶剂多为有机溶剂,萃取液滴体积小,易挥发,不易高温萃取且萃取维持时间短等。因此本文充分利用离子液体的非挥发性、溶解性能高、较大的黏度和密度等特性特性,设计了离子液体—单滴微萃取技术应用于药物中的高沸点的挥发性成分的分析测定,并对单滴的悬滴装置的改进,增大了液滴的体积,从而提高了液滴的稳定性和方法的灵敏度,使得改进的方法可用于可在高温下大液滴长时间萃取分析药物中的高沸点挥发性成分,最终采用此法分析测定了复方鲜竹沥液中愈创木酚的含量及复方甘草片中樟脑和反式茴香脑的含量,避免了传统萃取方法的缺点,直接进样HPLC分析测定,操作简单快速,结果准确,环境友好。综上研究,本文建立的药物中挥发性成分的分析检测的新的样品前处理方法,弥补以往样品前处理的不足,为药物中挥发性成分的质量控制提供简便、快速、灵敏的前处理手段。第一部分传统顶空溶剂HS-GC在药物中挥发性成分的分析研究与应用一、水为顶空溶剂的HS-GC测定藿香正气口服液中乙醇残留量目的:解决直接进样对色谱系统的污染及对待测物的干扰问题,建立HS-GC测定藿香正气口服液中残留溶剂乙醇的含量。方法:以水为顶空溶剂,在80℃的顶空温度下顶空平衡25 min,抽取上部顶部气体0.5 mL进样测定。采用DM-WAX毛细管柱(30 m×0.32mm×0.25μm),柱温:70℃;进样口温度:150℃;FID检测器,温度:200℃。结果:该法避免了直接进样的诸多不足,线性范围宽、回收率好、灵敏度高。方法验证表明被测溶剂乙醇在1.95~5.00×102μg·mL-1的范围内线性关系良好(r=0.999 9),平均回收率为96.5%(RSD=1.5%),检测限达0.122μg·mL-1。结论:该方法简单、准确、灵敏,以水作为顶空溶剂,避免了其他高沸点的顶空溶剂如DMF、DMSO等在顶空时挥发产生极大的溶剂峰干扰待测组分的测定,又不污染色谱系统,适用于藿香正气口服液中乙醇残留的含量测定。二、加改性剂的水为顶空溶剂的HS-GC测定罗浮山百草油中薄荷脑和水杨酸甲酯的含量目的:通过加入改性剂的方法,解决脂溶性药物百草油及挥发性成分百草油和水杨酸甲酯的溶解问题,建立一种简单快速的HS-GC测定罗浮山百草油中薄荷脑和水杨酸甲酯含量。方法:将样品的甲醇溶液50μL直接注入2 mL水中顶空分析,在80℃的顶空温度下顶空平衡30 min,抽取上部顶部气体1.0 mL进样测定。采用SMA-WAX (30 m×0.53 mm×0.50μm)的毛细管柱,聚乙二醇为固定液,程序升温,起始温度100℃保持3 min,4℃/min升到112℃,再以10℃/min到152℃,保持5 min;进样口温度:200℃;FID检测器温度:230℃。结果:该法避免了复杂的样品前处理,薄荷脑、水杨酸甲酯和其他成分的分离度良好,其加样回收率分别为99.2%和98.1%,RSD分别为0.5%和0.9%。薄荷脑和水杨酸甲酯分别在62.4~9.98×102μg·mL-1和1.25×102~2.00×103μg·mL-1的范围内线性关系良好,r均大于0.999 0。两种成分的检测限分别为1.95μg·mL-1、7.81μg·mL-1。结论:该方法操作简单快速,定量准确,改性剂—甲醇的加入既解决了样品的溶解问题,同时其在顶空溶剂中所占分数较小,进入色谱柱的量相对较小,而且甲醇保留时间也较短,不干扰测定,该法适用于罗浮山百草油的质量控制。三、加入增溶剂的水为顶空溶剂的HS-GC测定萘敏维滴眼液中薄荷醇的含量目的:采用加入增溶剂聚山梨酯80的方法,解决薄荷醇的溶解问题和提高方法的灵敏度,建立简单快速的HS-GC分析检测萘敏维滴眼液中的微量薄荷醇含量。方法:以0.1%聚山梨酯80溶液为顶空溶剂,在85℃顶空平衡20 min,抽取顶空气体1.0 mL进样测定。采用SMA-WAX毛细管柱(30 m×0.53 mm×0.50μm),固定液聚乙二醇;柱温125℃;进样口温度150℃;FID检测器温度170℃。结果:该法避免了复杂的样品前处理,回收率和重现性良好、待测组分达到了高富集,方法的灵敏度高。方法验证表明薄荷醇在2.4～76.8μg·mL-1浓度范围内线性关系良好(r=0.999 4),回收率在100.4~101.1%,RSD小于1.5%,薄荷醇的检测限达9.45μg·L-1。结论:该方法操作简单快速,定量准确,0.1%的聚山梨酯80溶液为顶空溶剂,既增大薄荷醇在水中的溶解度,又保证了较高的顶空效率,灵敏度高,可用于制剂中微量薄荷醇的质量控制。第二部分新型顶空溶剂-离子液体HS-GC在药物中挥发性成分-有机残留溶剂的分配行为的理论研究:定量预测离子液体—顶空空间分配系数的模型的建立目的:通过采用HS-GC研究某些有机溶剂在离子液体和顶空空间的分配行为,建立对待测溶剂具有理想顶空分配行为的离子液体模型。方法:以三种常用的咪唑基离子液体为顶空溶剂分析检测八种醇类溶剂,在100℃的顶空温度下顶空平衡时间30 min,气体进样0.5 mL。采用ZM-1毛细管柱(60 m×0.53 mm×5.00μm),起始柱温为50℃,保持2 min,以5℃/min升至130℃保持2 min;进样口温度:180℃;FID检测器,温度:200℃。结果:通过实验计算得出顶空分配系数,采用统计软件SPSS13.0分析处理各种参数的关系,建立了可用于预测离子液体-顶空空间分配系数的模型,模型中引入了溶剂的物理性质参数—沸点和油水分配系数,并得到了三个回归方程,相关系数均大于0.988。结论:该方法可以用于更多的离子液体和有机溶剂,因为分配系数与方法的灵敏度成反比,离子液体分配模型的建立对简单快速选择合适的离子液体作为顶空溶剂检测有机残留溶剂具有重要意义。第三部分HS-SDME在药物中挥发性成分的分析研究与应用一、DMF为萃取溶剂的HS-SDME-GC快速分析百草油中挥发性成分的含量目的:进一步改善直接HS-GC的灵敏度,采用简单、快速、灵敏的HS-SDME-GC分析测定百草油中挥发性成分薄荷醇和水杨酸甲酯含量。方法:精密吸取样品的甲醇溶液10μL注入盛有5 mL水的样品瓶中,以1.5μL DMF为萃取溶液(含内标苯甲醇),萃取温度为40℃、萃取时间为5 min,萃取后直接吸回0.5μL进样GC分析检测。采用30m×0.53mm PEG毛细管柱,其他色谱条件见第一部分(二)。结果:该方法的薄荷醇、水杨酸甲酯和其他成分的分离度良好,加样回收率在95.4%~99.2%之间,RSD均低于1.9%。薄荷醇和水杨酸甲酯分别在1.26~80.5μg·mL-1(r=0.9990)和2.48~1.59×102μg·mL-1(r=0.9991)的范围内线性关系良好。两种成分的最低检测限分别为7.86×10-2μg·mL-1、0.156μg·mL-1,较直接HS-GC的灵敏度更高。结论:该方法避免了复杂的样品前处理,操作简单快速,仅5 min即完成萃取、纯化,适用于中药及其制剂中挥发性成分的含量测定。二、新型离子液体为萃取溶剂的HS-SDME-HPLC分析测定中药中的高沸点挥发性成分目的:充分利用离子液体的非挥发性、溶解性能高、较大的黏度和密度等特性特性,设计了离子液体HS-SDME技术应用于药物中的高沸点的挥发性成分的分析测定,避免常用萃取有机溶剂萃取液滴体积小,易挥发,不易高温萃取且萃取维持时间短等缺点,并改进单滴的悬滴装置,提高液滴的稳定性和方法的灵敏度,使HS-SDME可用于高温下大液滴长时间萃取分析药物中的高沸点挥发性成分,并分析测定复方鲜竹沥液中愈创木酚的含量。方法:通过改进悬滴装置,增大了液滴与微量进样器针尖处塑料套管的接触面积,使离子液体的液滴体积达12μL,提高了液滴的稳定性及方法的灵敏度。以12μL 1-丁基-3-甲基咪唑基六氟磷酸盐([BMIM][PF6])为悬滴,在5 mL含36%(w/v)NaCl的样品液中,萃取温度80℃、搅拌速度1000 rpm的条件下,顶空萃取30 min,萃取后直接将液滴吸回微量进样器,进样HPLC分析检测。色谱柱:Kromasil C18柱(150×4.6 mm,5μm),流动相:1%冰醋酸水溶液:甲醇(体积比70:30);流速:1.0 mL/min;检测波长:274 nm;柱温:室温。结果:该法避免了传统方法的不足,结果准确,灵敏度高。方法验证表明愈创木酚在5.04×10-2~1.61μg·mL-1的范围内线性关系良好(r=0.9997),检出限为0.394μg·L-1,愈创木酚的加样回收率为97.6%,RSD为2.5%。结论:该方法操作简单快速,定量准确,成本低,无污染,且避免了复杂的样品前处理,解决了传统萃取溶剂及原有萃取装置的诸多不足,适用于分析测定药物中的高沸点挥发性成分的含量。三、新型离子液体为萃取溶剂的HS-SDME-HPLC分析测定复方甘草片中的樟脑和反式茴香脑的含量目的:充分利用离子液体的特性及改进的悬滴装置,建立了一种离子液体HS-SDME-HPLC分析测定复方甘草片中樟脑和反式茴香脑的含量。方法:通过改进悬滴装置,增大了液滴与微量进样器针尖处塑料套管的接触面积,使离子液体的液滴体积达12μL,提高了液滴的稳定性及方法的灵敏度。通过系统考察影响离子液体顶空单滴微萃取的因素(离子液体类型,液滴体积,转速,离子强度,萃取温度和萃取时间),确立了最佳的萃取条件后进样HPLC分析检测。液相色谱条件为色谱柱:Promosil C18柱(150 mm×4.6 mm,5μm),流动相:甲醇:水(体积比70:30);流速:1.0 mL/min;检测波长:289 nm;柱温:35℃。结果:樟脑和反式茴香脑均在0.156~10.0μg·mL?1的范围内线性关系良好(r=0.9990,0.9998),樟脑和反式茴香脑的回收率为98.5~101.2%,RSD均低于4.2%,检测限分别为9.77和1.95×10-2μg·L?1。结论:该萃取过程在密闭的空间内集分离、纯化与富集于一体,既减少了干扰成分,提高了灵敏度,又不易造成挥发性成分的损失,定量准确。该方法成功的用于复方甘草片中樟脑和反式茴香脑的分析检测,并有望成为其他复杂基质的药物例如植物提取物、中药等中的高沸点挥发性成分的样品前处理的方法。