第一部分重型血友病甲患者的基因诊断及发病机制研究【目的】血友病甲(Hemophilia A,HA)为一种X染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病,在男性人群中发病率为1/5000,女性患者极为罕见。患者自幼可有反复的关节出血,严重者可发生脑出血危及生命。根据血浆中凝血因子VIII活性(FVIII:C)的不同将其分为轻、中、重三型。目前针对本病的治疗主要依赖浓缩凝血因子VIII替代治疗,尤其对于重型血友病患者来说,治疗费用大,生活质量差,所以对血友病患者家系及时进行基因检测,及早的发现携带者,可以有效的减少血友病患儿的诞生。【方法】对2009年至2014年期间在苏州大学附属第一医院血友病中心就诊的43例重型血友病甲男性患者进行FVIII基因突变的检测,其中用长距离PCR法检测22号内含子倒位,双管PCR法检测1号内含子倒位,以及FVIII基因26个外显子及其侧翼序列的直接测序并将测序结果和NCBI基因库(genebank)所公布的FVIII(NM.000132.3)基因序列进比对,寻找基因突变,并排除多态性。【结果】43例患者中,21例患者发现22号内含子倒位(占48.8%),1号内含子突变未发现。余下22例患者均发现基因突变位点,共有21种突变,其中点突变13例,小片段缺失7例(其中2例为同种突变),小片段插入2例;其中导致氨基酸错义突变5例,无义突变6例,移码突变9例,剪接位点突变2例。其中7种基因突变国际上未见报到,为首次发现。分别为:c.214G>T(E72X),c.215T>C(F73S),IVS5+2G>A(splicing),c.2519C>G(S840X),c.3180del A(V1061Xfs),c.5639del A(N1880Tfs*3),c.6572del A(N2191Mfs*18)。【结论】43例HA患者的基因分析表明FVIII基因突变具有明显的异质性,22号内含子倒位是重型血友病A患者的主要突变方式。通过分析7例新的突变的发病机制,对血友病A发病机制的的进一步研究提供了基础,血友病甲携带者及孕妇进行快速、准确的诊断打下了基础。第二部分重型血友病A患者凝血因子VIII抑制物检测及其产生影响因素的分析【研究目的】血友病甲(Hemophilia A,HA)是由于凝血因子VIII(FVIII)基因缺陷,导致的血浆FVIII质或量的异常而引起的一种X染色体连锁的隐形遗传性出血性疾病。目前本病主要治疗方法为FVIII制剂的替代治疗,而FVIII抑制物是血友病A患者反复输注FVIII制剂后产生的一种同种抗体,有中和并完全灭活FVIII活性的作用,是血友病A患者发生的最严重的并发症。近年来随着血友病替代治疗的不断推广,重型HA患者接受替代治疗的强度较以往大大增加,因此抑制物的防治也越来越得到重视,在本研究中我们对2004年至2014年期间在我院确诊的重型血友病患者进行抑制物产生影响因素的分析,旨在指导临床上重型血友病A患者的治疗。【方法】收集2009年至2014年期间在苏州大学附属一院血友病中心确诊的43例重型血友病甲(HA)男性患者外周血样本,运用Nijmegen改良的Bethesda方法对43例患者进行FVIII抑制物的检测。进一步分析患者抑制物的发生与首次接受替代治疗的年龄、暴露日、FVIII基因突变类型因素的相关性。【结果】43例男性重型血友病A患者,首次接受替代治疗的年龄<1岁组的14例(32.6%),1~5岁组22例(51.2%),≥5岁组7例(16.3%)。暴露日<10ED组的患者15例(34.9%),10~50ED组8例(18.6%),≥50ED组20(46.5%)例。43例患者中抑制物阳性患者9例(占20.9%),中位抑制物滴度0.82BU(0~14BU),阴性患者34例(占79.1%)。FVIII基因突变类型中无效突变38例(88.4%),非无效突变5例(11.6%)。对43例接受过替代治疗的重型血友病A患者进行发生抑制物的单因素及多因素分析,在观察的诸多因素中,包括首次替代治疗年龄、暴露日及突变类型与患者是否出现抑制物差异均无统计学意义(P>0.05)。【讨论】血友病患者抑制物产生的影响因素众多,如何能够有效的减少抑制物的发生,仍然需要进行不断的大样本研究。如能根据发生抑制物的危险程度,对血友病患者进行分层治疗将会更加有意义。第三部分凝血因子IX酶催化区突变致女性血友病乙一例试验研究【研究目的】血友病乙(Hemophilia B,HB)是一种X连锁隐性遗传性出血性疾病,多为男性发病,女性血友病乙患者罕见,本研究对一例女性血友病乙患者进行表型和基因型分析,探讨其发病机制。【方法】对一例女性血友病乙先证者、其父母及其女儿进行血浆部分活化凝血酶原时间(APTT)、凝血酶原时间(PT),血浆凝血因子IX活性(FIX:C),血浆凝血因子VIII活性(FVIII:C)测定,并进行FIX抑制物活性测定;运用PCR技术对先证者及其父母、女儿的FIX基因的所有外显子及其侧翼序列进行PCR扩增,产物经测序分析并寻找突变位点;对先证者及其父母运用多重荧光PCR技术检测16个STR位点进行亲子分析。用Western blot的方法检测患者血浆中FIX蛋白含量。在HEK293细胞中分别转染野生型质粒、突变型质粒以及突变型/野生型双质粒共转染,继而使用Western blot的方法检测细胞上清液及裂解液的FIX蛋白含量。通过PCR联合甲基化敏感的限制性内切酶Hha I酶切PCR产物的方法检测ZNF261基因上的甲基化位点,检测患者是否存在X染色体非随机失活。【结果】先证者因头部外伤后颅内血肿入院,既往有产后出血过多及术后出血难止病史。父母非近亲结婚,均无出血病史。先证者血浆APTT 62.2s,PT 13.9s,FIX:C 2%,FVIII:C148%,FIX抑制物阴性;患者父母、女儿血浆APTT、PT、FIX:C、FVIII:C均正常。FIX基因分析发现,先证者FIX基因的8号外显子存在T1108G(Phe314Cys)杂合突变,已排除基因多态性,且此突变国际上尚无报道;患者父母及女儿FIX基因测序结果均正常。STR分析证实先证者与其父母为亲子关系。患者血浆中存在FIX蛋白,与正常人相比无明显差别。体外表达实验发现,转染野生型F9WT质粒的细胞与转染F9MT(Phe314Cys)质粒的细胞以及F9WT/F9MT双质粒共转染的细胞,进行比较,表达上清中及细胞裂解液中FIX蛋白的含量无明显差别。X染色体非随机失活实验证实患者来源于母亲的X染色体发生了甲基化不能被酶切,而来源于父亲的X染色体被完全酶切。【讨论】血友病乙为X染色体连锁隐性遗传性出血疾病,女性罕见,女性发病机制主要是X染色体的非随机失活、X染色体的结构异常或FIX基因的纯合突变所致。先证者临床特点及表型检测结果符合血友病乙,基因分析结果证实先证者的FIX基因8号外显子存在T36029G(Phe314Cys)杂合突变,突变位于酶催化区域,该突变导致患者血浆中FIX活性下降,但并未影响FIX蛋白的表达与分泌。患者父母体细胞检测未发现FIX突变,且患者来源于母亲的X染色体完全甲基化失活,因此我们推测患者FIX杂合突变来源于父亲的精原细胞突变。