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背景与目的: 血管内皮生长因子C(VEGF-C)属于血管内皮生长因子/血小板源生长因子(VEGF/PDGF)家族,是一种多肽类生长因子,于1996年被首次发现,通过酪氨酸激酶受体VEGFR-2和VEGFR-3发挥作用,在人类多种正常细胞及肿瘤组织和鸟类及小鼠的胚胎中均有表达,其表达水平有一定的组织特点,并受多种因素的调节。VEGF-C具有多种生物活性,对于胚胎发育、细胞分化以及体内外的血管、淋巴管内皮细胞的增殖均有重要的调节功能。 血管内皮生长因子(VEGF)是重要的血管内皮生长因子,而同一家族的VEGF-C则被认为是首要的淋巴管内皮生长调节因子。VEGF-C转基因鼠的实验证明:VEGF-C的高表达可选择性诱导实验鼠皮肤的淋巴管的增生和形成,对血管内皮细胞则不起作用。重组VEGF-C可特异性的促进绒毛膜尿囊中淋巴管的增生。近年有关VEGF-C的研究内容主要集中于该因子在肿瘤的表达、与肿瘤淋巴管形成及与肿瘤的淋巴转移以及肿瘤预后之间的关系等方面。大量实验表明:VEGF-C的表达与癌周淋巴管形成及与肿瘤的淋巴转移呈正相关,其机制很有可能是VEGF-C通过促进淋巴管内皮的增生使肿瘤细胞通过淋巴管转移变得更为容易。关于VEGF-C的另一个重要研究内容是该因子对于淋巴管缺陷性疾病的潜在治疗作用。已有实验证实:VEGF-C蛋白对于兔耳获得性淋巴水肿模型具有一定的治疗作用。 目前,与VEGF-C同家族的生长因子VEGF已被广泛应用于缺血性心、脑血管系统疾病和有关肿瘤的基因治疗研究中,并已取得显著成果,某些发达国家已进入一期临床实验阶段,而VEGF-C基因的应用研究尚处于起步阶段。 本课题组自1999对VEGF-C在肿瘤淋巴转移中的生物学功能及其应用等方面开始了一系列的研究。为了探讨VGEF-C在淋巴管生成和调节淋巴管内皮细胞过程中的作用机制,探索抑制肿瘤淋巴转移的新方法,并进一步应用VEGF-C基因治疗某些淋巴管形成缺陷性疾病,我们设计并完成了以下三部分的实验。山东大学博士学位论文 第一部分:花GF{基因真核表达载体的构建及其在CHO细 胞中的表达方法: 1.根据VEGF一C DNA序列,设计特异性引物。培养人乳腺癌MCF一7细胞,提取总RNA,应用RT-PCR的方法从MCF一7细胞中克隆VEGF一C cDNA片断,回收PCR产物,并将其连接至克隆载体pMD 18一中;重组的pMD18一T在大肠杆菌DE[5a内扩增后,经质粒提取、EedRI和BamHI酶切,筛选出阳性重组子,并进行基因测序鉴定,以确定该序列含有VEGF一C cDNA全长。 2,琼脂糖凝胶电泳回收含有VEGF一C七DNA全长的酶切片断,然后在T4DNA连接酶作用下将其与真核表达载体体DNA3 .1(·)连接,重组质粒讲DNA3.1(一)/VEGF一经限制性内切酶EedRI和B别mHI酶切予以鉴定。 3.脂质体介导娜DNA3.1(.户尼GF一C质粒转染入CHO细胞并用G418筛选,收集培养液上清以及细胞裂解液进行叭吧鱿em一blotting检测vEGF一蛋白。结果: 1.琼脂糖凝胶电泳显示PT-PCR产物中含有VEGF一c]臣NA片断,基因测序证实:插入pMD18一载体中的Pf-pCR产物包含正确的人VEGF毛cDNA全长序列。 2,限制性内切酶EcoRI和BamHI酶切结果证实:重组的详DNA3,1(一)中含有人VEGF一cDNA全长序列。 3.,触s咖一blotting实验显示:细胞培养卜清以及细胞裂解液中均可见到VEGF心蛋白的表达结论: 运用分子生物学技术,成功获得人VEGF一C cDNA全长序列,并将其插入了真核表达载体.1(一)中,成功地构建了人VEGF一基因真核表达载体.1(一)刃EGF一C,并在真核细胞CHO中检测到了VEGF一C蛋白的表达,为进一步进行体外表达试验奠定了基础。山东大学博士学位论文第二部分:荧光真核表达载体的构建和体外表达方法: 1.分别提取peDNA3.1卜yvEGF一和质粒博GFP一1并酶切鉴定,将两种质粒分别单酶切,末端平滑化,再用B别mHI酶切,回收质粒详。NA3.1(一)/vEGF一C和插入片段绿色荧光蛋白基因EGFP并鉴定。 2.连接两片断,电泳鉴定并测序 3.脂质体介导体DNA3.1(.yVEGF一C.EGFp质粒转染到CHO细胞,观察荧光蛋白基因表达情况。 4.筛选CHO细胞阳性克隆。RT-PCR检测目的基因在CHO细胞中的表达结果: 1.处理后的基因片断经琼脂糖凝胶电泳鉴定,连接后的基因片断测序证实插入的基因片段无误。 2.构建好的载体经脂质体介导转染到CHO细胞中并观测到荧光蛋白的表达。 3.RFPCR结果证实,目的基因在CHO细胞中有表达。结论: 运用分子生物学技术,获得绿色荧光蛋白基因,并将该基因插入到已经构建成功的VEGF一C基因真核表达载体中,获得含有绿色荧光蛋白基因的VEGF毛真核表达载体。该载体转染到CHO细胞中,并观测到绿色荧光,证实载体成功构建,RT-PCR反应检测到了VEGF一C RNA在阳性转染克隆中的表达,同样证实了载体的成功构建。为进一步研究VEGF一C的生物学功能以及临床应用获得了更直观的研究工具。第三部分:真核表达载体在治疗继发性淋巴水肿中的应用方法: l用质粒大提试剂盒大量提取已经构建成功的真核表达载体。山东大学博士学位论文 3结果: l制作人鼠淋巴水肿模型,将提取的真核表达载体注射到模型人鼠的水肿处。用hnU,B超,光镜等方法观测试验组和对照组大鼠的淋巴水肿改善情况。提取了