论文部分内容阅读
第一部分Slug和E-cadherin在结直肠组织中表达及临床意义目的：探讨Slug和E-cadherin在结直肠癌组织中的表达及预后意义及二者可能存在的相关性。方法：应用免疫组化SP法检测65例结直肠癌组织,25例癌旁正常结直肠组织中Slug和E-cadherin的表达,分析两者表达水平与临床病理特征及患者预后的关系。结果：Slug在结直肠癌组织中异常表达率为47.1%,而在正常结直肠组织中表达率为12%,差异有统计学意义(p<0.01)；E-cadherin在结直肠癌组织中异常表达率为55.4%,而在正常结直肠组织中表达率为8%,差异有统计学意义p<0.01)；两者阳性表达率与肿瘤浸润深度、分化程度、淋巴结转移、分期相关性均有统计学意义(P<0.05)。相关性分析显示Slug和E-cadherin无相关性,结论：Slug和E-cadherin的表达异常可能与结直肠癌的发生发展、转移相关并可作为评价结直肠癌生物学行为和预后的重要指标。第二部分Slug基因RNAi慢病毒载体的制备、包装与病毒滴度测定目的：构建Slug基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体。方法：筛选出能有效抑制结肠癌细胞中的Slug基因表达的siRNA序列：设计出4个针对靶基因Slug序列的siRNA序列,构建重组shRNA质粒,并小量包装shRNA慢病毒表达载体,同时转染入结肠癌细胞HCT116中,采用荧光定量PCR与WB法分别测定转染后HCT116细胞中Slug mRNA和蛋白的表达水平,验证沉默效果,筛选出有效的靶点。构建pGC-Slug-GFP,将筛选出来的siRNA序列构建成重组shRNA质粒,并大量包装,同时检测病毒的滴度。结果：成功构建慢病毒表达载体pGC-Slug-GFP,三质粒共转染293T细胞后可见大量绿色荧光；浓缩病毒后测定其滴度为2×107TU/ml;以复感染系数MOI为1感染293T细胞,感染效率在90%以上。RT-PCR与Western blot证实Slug RNAi’漫病毒载体能够抑制Slug的表达。结论：成功构建Slug’慢病毒表达载体,包装得到高滴度慢病毒,为后续感染结肠癌细胞,探索其在结直肠癌发生和发展中的作用奠定了基础。第三部分慢病毒介导的RNA干扰沉默Slug基因对结肠癌HCT116细胞生物学行为的影响目的：探讨利用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术研究沉默Slug基因,对结肠癌HCT116细胞增殖和周期的影响。方法：构建Slug基因特异性siRNA慢病毒载体,感染结肠癌HCT116细胞,设立未转染组、阴性对照组及转染组三组,MTT法和克隆形成实验检测Slug基因在siRNA作用下的细胞增殖率,划痕愈合实验测定细胞运动性,流式细胞仪检测细胞凋亡周期变化情况,Transwell法检测各组细胞侵袭能力的变化。结果：转染Slug siRNA后,MTT和克隆形成实验检测,干扰组细胞增殖水平明显低于阴性对照组；流式细胞仪检测细胞G1期细胞百分比(52.3±0.6)高于阴性对照组(45.1±0.3)(P<0.05)。Transwell小室细胞迁移检测结果显示：KD组穿透滤过膜细胞数量较CON和NC组明显减少(P<0.05)；划痕愈合实验结果示细胞运动能力下降明显(P<0.05)。结论：Slug siRNA能明显下调靶基因Slug的表达,在体外可抑制结肠癌HCT116细胞的生长。