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第一部分可视化抗耐药型纳米粒的制备、表征及稳定性等检测目的:1.制备一种肿瘤归巢穿膜肽功能化（t Ly P-1）聚乙烯亚胺（Polyethylenimine,PEI）修饰的载紫杉醇（paclitaxel,PTX）与卟啉铜（Porphyrin copper,Cu TCPP）的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Poly（lactic-co-glycolic acid）,PLGA）纳米粒,并对可视化抗耐药纳米粒粒径、电位、紫外光谱等基本表征进行检测。2.对可视化抗耐药型纳米粒（TPP@PTX-Cu TCPP）的载药性能、药物释放能力及纳米载体生物安全性进行评估。方法:采用马来亚酰胺法合成肿瘤归巢穿膜肽功能化聚乙烯亚胺（t Ly P-1-PEI）,利用超声双乳化法制备携载PTX和Cu TCPP的PLGA纳米粒,最后使用碳二亚胺法将t Ly P-1-PEI与羧基化PLGA纳米粒共价连接。合成及制备成功后,使用傅里叶红外光谱仪（FTIR）、核磁共振氢谱（NMR）及飞行时间质谱仪（TOF-MS）检测t Ly P-1-PEI和t Ly P-1-PEI-PLGA合成情况。使用透射电镜（TEM）及扫描电镜（SEM）检测纳米粒形貌特征,使用紫外分光光度计（UV）检测纳米粒携载Cu TCPP情况及估算其携载量。使用高效液相色谱仪（HPLC）检测纳米粒携载PTX情况及估算其携载量。使用高效液相色谱仪检测TPP@PTX-Cu TCPP在不同PH环境下释放PTX的情况,使用CCK-8法检测未携载PTX的纳米载体TPP@Cu TCPP的生物安全性。结果:采用马来酰亚胺法和碳二亚胺法成功合成了t Ly P-1-PEI及t Ly P-1-PEI-PLGA。NMR结果显示t Ly P-1-PEI在2.6～3.0 ppm处出现了与PEI接近的峰值,TOF-MS结果显示PLGA纳米空球在与t Ly P-1-PEI共价连接后纳米粒分子量由14955.22 Da增加到20722.68 Da。FTIR结果显示,t Ly P-1-PEI-PLGA及PEI-PLGA纳米空球在3002/cm及2948/cm附近出现代表PLGA的-CH基团的特征峰,同时在1649/cm和3426/cm附近出现了代表-CO-NH-和-NH2基团的特征峰,而PLGA空球中仅在3002/cm和2948/cm附近出现了代表PLGA的-CH基团。这些结果说明成功合成了t Ly P-1-PEI和t Ly P-1-PEI-PLGA。t Ly P-1-PEI中的氨基可能与PLGA纳米粒的羧基形成酰胺键产生了共价连接。透射电镜及扫描电镜下观察到纳米粒呈球形,分布均匀,大小均一。经马尔文粒径分析仪测得纳米粒的粒径约354.8 nm,PDI:0.14。同时纳米粒在去离子水、含胎牛血清的1640培养基及磷酸缓冲盐溶液（PBS）中重悬后,粒径未发生明显变化。经检测,未经修饰的携载Cu TCPP和PTX的PLGA纳米粒（P@PTX-Cu TCPP）、PEI修饰的携载Cu TCPP和PTX的PLGA纳米粒（PP@PTX-Cu TCPP）及t Ly P-1功能化PEI修饰的携载Cu TCPP和PTX的PLGA纳米粒（TPP@PTX-Cu TCPP）表面电荷分别为-13.6 m V,3.92 m V和8.42 m V。紫外分光光度计检测显示TPP@PTX未发现明显特征峰,Cu TCPP在412 nm处出现一特征峰,而TPP@PTX-Cu TCPP在415 nm处出现一特征峰,较Cu TCPP原溶液有较小的红移。根据Cu TCPP标准曲线计算得到抗耐药型纳米粒对Cu TCPP的包封率为27.1%,载药量为2.25%。高效液相色谱测得抗耐药型纳米粒对PTX的包封率为70.1%,载药量为5.84%。通过HPLC分析发现,TPP@PTX-Cu TCPP具有缓慢释放PTX的能力,且在弱酸性环境（PH=6.3）中的释放速率高于中性环境（PH=7.4）。CCK-8法测得耐药型乳腺癌细胞MCF-7/Taxol及人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）与不同浓度未携载PTX的纳米载体TPP@Cu TCPP共孵育24小时后的细胞存活率均大于80%。结论:成功制备肽功能化聚乙烯亚胺修饰的载紫杉醇和卟啉铜的抗耐药型PLGA纳米粒TPP@PTX-Cu TCPP,该纳米粒呈球形,分布均一,在不同溶液环境下稳定性好,具有较好的携载PTX和Cu TCPP的能力。TPP@PTX-Cu TCPP纳米粒在弱酸环境下具有良好的药物释放能力,同时PLGA作为药物递送载体具有良好的生物相容性。第二部分可视化抗耐药型纳米粒多策略协同体外对抗肿瘤多药耐药效能及其光声成像性能评估第一节溶酶体逃逸、谷胱甘肽消耗及肿瘤归巢穿膜策略协同逆转耐药体外效果评估目的:评估溶酶体逃逸、谷胱甘肽消耗及肿瘤归巢穿膜策略体外协同逆转肿瘤多药耐药的效能。方法:共聚焦荧光显微镜及生物透射电镜观测经PEI修饰的纳米粒（PP@PTX）和未经PEI修饰的纳米粒（P@PTX）触发溶酶体逃逸效果;谷胱甘肽检测试剂盒及X射线光电子能谱仪（XPS）检测携载Cu TCPP后纳米粒体内外消耗谷胱甘肽的能力;建立乳腺癌耐药细胞三维肿瘤球和耐药型乳腺癌（MCF-7/Taxol）皮下移植瘤模型,使用共聚焦荧光显微镜及小动物活体荧光成像仪评估经肿瘤归巢穿膜肽功能化后,抗耐药型纳米粒对肿瘤体内外靶向及穿膜效果。CCK-8法、流式细胞术凋亡染色及钙黄绿素/碘化丙啶（Calcein-AM/PI）双染色法评估不同抗耐药策略纳米粒及可视化抗耐药型纳米粒对MCF-7/Taxol细胞的体外抑制效果。结果:共聚焦荧光显微镜观察发现,PP@PTX组中代表纳米粒的红色荧光与代表溶酶体的绿色荧光重合度较P@PTX组降低,Image J软件分析得出,PP@PTX组中纳米粒与溶酶体的皮尔森相关系数（PCC）为0.511,而P@PTX组为0.871,具有统计学差异（P＜0.05）。同时,使用PP@PTX、P@PTX和FITC-PTX与MCF-7/Taxol细胞共孵育24小时,然后将溶液换为无血清细胞培养基后再次观测发现,PP@PTX组仍保留有大量纳米粒的荧光,而P@PTX组和FITC-PTX组则较少。生物透射电镜观察发现,与PP@PTX共孵育前,MCF-7/Taxol细胞内的溶酶体呈椭圆形,溶酶体膜完整。当与PP@PTX共孵育6小时后,MCF-7/Taxol细胞内的溶酶体膜失去完整性,部分溶酶体肿胀破裂。谷胱甘肽检测试剂盒检测与Cu TCPP和携载了Cu TCPP的PLGA纳米粒（PLGA-Cu TCPP）共孵育后的谷胱甘肽溶液及MCF-7/Taxol细胞,发现二者内的谷胱甘肽含量均下降。XPS检测发现Cu TCPP溶液中代表2价铜离子的特征卫星峰下降,2价铜离子含量由96.4%下降到30.7%。使用共聚焦荧光显微镜评估t Ly P-1功能化的抗耐药纳米粒（TPP@PTX-Cu TCPP）与未经t Ly P-1功能化的纳米粒（PP@PTX-Cu TCPP）对MCF-7/Taxol细胞及MCF-7/Taxol三维肿瘤细胞球肿瘤靶向、穿膜效果,发现TPP@PTX-Cu TCPP纳米粒与MCF-7/Taxol细胞共孵育2小时后,能大量聚集在其细胞周围。TPP@PTX-Cu TCPP纳米粒在MCF-7/Taxol三维肿瘤球模型中的穿透深度为21.3μm,而PP@PTX-Cu TCPP的穿透深度仅为7.55μm。MCF-7/Taxol皮下移植瘤模型中发现,TPP@PTX-Cu TCPP在肿瘤组织处的荧光信号较PP@PTX-Cu TCPP信号更强,且在6小时达峰。肿瘤组织免疫荧光切片显示,TPP@PTX-Cu TCPP纳米粒能够穿越肿瘤血管屏障,进入肿瘤组织更深层次区域。CCK-8法、流式细胞术凋亡染色及Calcein-AM/PI双染色法检测发现TPP@PTX-Cu TCPP组细胞存活率最低（P＜0.05）,同时具备溶酶体逃逸、谷胱甘肽消耗及肿瘤归巢穿膜策略的抗耐药型纳米粒药物联合指数（CI）为0.201,对抑制MCF-7/Taxol细胞具有强协同效应。第二节可视化抗耐药型纳米粒体外及活体内乳腺癌光声成像效果评估目的:观察TPP@PTX-Cu TCPP抗耐药型纳米粒作为光声造影剂体外及乳腺癌活体内成像的能力。方法:建立琼脂凝胶模型,利用光声成像仪对置于凝胶模型中不同浓度的TPP@PTX-Cu TCPP进行光声信号强度分析;建立MCF-7/Taxol皮下移植瘤模型,观察靶向及无靶向抗耐药型纳米粒的活体内乳腺癌光声成像效果。结果:体外光声结果显示TPP@PTX-Cu TCPP纳米粒在近红外区695 nm处有一明显的吸收峰,纳米粒光声信号随着纳米粒中的Cu TCPP的浓度增强而增强,呈线性关系。活体内乳腺癌成像结果显示,荷瘤小鼠经尾静脉注射TPP@PTX-Cu TCPP后,肿瘤区域开始出现明显的光声信号,并在6小时达到峰值,而PP@PTX-Cu TCPP组肿瘤区域产生的光声信号较弱。结论:可视化抗耐药型纳米粒同时具备了溶酶体逃逸、谷胱甘肽消耗和肿瘤归巢穿膜的能力,在体外抑制MCF-7/Taxol细胞的生长时具有明显的协同作用。TPP@PTX-Cu TCPP纳米粒在体内外光声成像中表现出了良好的光声成像性能,展示了其作为肿瘤光声造影剂的应用前景。第三部分可视化抗耐药型纳米粒多策略协同体内对抗肿瘤多药耐药效能评估目的:评估TPP@PTX-Cu TCPP纳米粒小鼠体内生物安全性及对荷耐药型乳腺癌MCF-7/Taxol裸鼠的化疗治疗结果。方法:将200μl TPP@PTX-Cu TCPP纳米粒溶液（PLGA浓度为5 mg/ml）经尾静脉注入昆明鼠体内,然后将同样剂量和浓度的TPP@PTX-Cu TCPP纳米粒在14天、21天、25天和27天后注射入小鼠体内,并在第27天时将生理盐水（对照）注射入小鼠体内。在第28天时处死小鼠并经眼眶静脉采血,检测小鼠肝、肾、心功能、肾功及血常规等生理指标;取出各组小鼠主要器官（包括心、肝、脾、肺、肾）并进行H＆E染色,分别观察各脏器切片的形态学改变。建立MCF-7/Taxol皮下移植瘤模型,将荷瘤裸鼠随机分为以下8组:对照组、游离PTX组、P@PTX组、P@PTX-Cu TCPP组、PP@PTX组、TPP@PTX组、PP@PTX-Cu TCPP组和、TPP@PTX-Cu TCPP组。每隔4天将各试剂经尾静脉注射入荷瘤小鼠体内后,每间隔4天分别测量荷瘤裸鼠体重及肿瘤体积。在第16天处死小鼠并在每组随机取出一只小鼠的主要脏器和肿瘤组织。对肿瘤组织进行H＆E、TUNEL和PCNA染色,对主要脏器进行H＆E染色。结果:注射TPP@PTX-Cu TCPP纳米粒后,不同时间节点的各组昆明鼠肝、肾、心功能以及血常规等指标与对照组相比无明显统计学差异（P＞0.05）,各组主要脏器H＆E染色未见明显异常。各组荷瘤裸鼠治疗后体重无差异变化,各主要器官的H＆E染色结果未见明显病理学损伤。对照组、游离PTX组及P@PTX组中肿瘤相对体积分别增长了7.21倍、5.50倍和4.97倍。含有一种抗耐药策略或多种抗耐药策略的纳米粒组荷瘤小鼠肿瘤生长速度慢于对照组,其中包含溶酶体逃逸、谷胱甘肽消耗和肿瘤归巢穿膜策略的纳米粒TPP@PTX-Cu TCPP,不仅能够抑制肿瘤生长,同时还能缩小肿瘤体积（肿瘤相对体积约0.988,肿瘤抑制率91.4%）。肿瘤组织H＆E染色结果显示,游离PTX组和P@PTX组对肿瘤细胞形态破坏较少。而随着抗耐药策略增多,部分肿瘤细胞出现细胞核固缩、碎裂及溶解,其中TPP@PTX-Cu TCPP组最明显。此外PCNA和TUNEL染色结果显示,TPP@PTX-Cu TCPP组相对于其余各组细胞增殖指数降低、凋亡指数升高。结论:TPP@PTX-Cu TCPP长、中、短期生物相容性良好,具有广阔的临床应用前景,TPP@PTX-Cu TCPP对MCF-7/Taxol肿瘤的抑制效果最佳,可视化抗耐药型纳米粒能够逆转耐药型乳腺癌的对化疗的敏感性。