魔芋葡甘露低聚糖酶法制备及对肉鸡生理活性的研究

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葡甘露低聚糖(GMOS)是一种由葡萄糖与甘露糖以β-1,4-糖苷键构成的功能性低聚糖,在饲料、食品、保健品等领域具有广阔的应用前景,但葡甘露低聚糖在肉鸡养殖中的应用研究鲜见报道。本文针对我国富含葡甘露聚糖的魔芋资源精深加工水平低的问题,开展魔芋葡甘露聚糖酶法制备高附加值葡甘露低聚糖及其在肉鸡养殖中的应用研究,为魔芋酶法制备葡甘露低聚糖的工业化生产及其在养殖业上的应用提供依据。本文主要研究结果如下:(1)针对天然微生物菌株合成的β-甘露聚糖酶中含有甘露糖苷酶,不适合对葡甘露聚糖定向降解制备葡甘露低聚糖的技术瓶颈,采用分子生物学手段,将黑曲霉源β-甘露聚糖酶基因成功导入毕赤酵母宿主中进行表达。筛选得到一株能够高效表达β-甘露聚糖酶的重组毕赤酵母工程菌株KM71H-MANNAN。通过调整高密度发酵参数,在3L发酵罐中于接种量10%、p H值5.0、溶解氧浓度控制在20%以上,高密度发酵96 h,β-甘露聚糖酶活力高达1986.31 U/m L,为酶法定向水解制备葡甘露低聚糖提供了重要的技术支撑。(2)以魔芋精粉提纯所得的高纯度葡甘露聚糖为底物,利用上述重组β-甘露聚糖酶进行定向水解制备葡甘露低聚糖。在最适酶水解条件为20g/L葡甘露聚糖、30 U/g葡甘露聚糖、温度50 oC、p H 5.0下,酶解2 h,葡甘露低聚糖得率达51.80%,酶对葡甘露低聚糖的选择性为98.0%,且葡甘露低聚糖以二糖和三糖为主。在此基础上,采用可工业化放大的超滤技术(截留分子量3500 Da)实现高纯度葡甘露低聚糖产品的制备,所得产品中葡甘露低聚糖纯度高达96.89%,重均分子量2200Da。(3)葡甘露低聚糖作为饲料添加剂在麻鸡养殖上的应用试验表明,日粮中添加葡甘露低聚糖对肉鸡的生长性能与肠道菌群分布无显著影响,但可显著提高麻鸡免疫器官法氏囊的相对重量,显著改善麻鸡肠道形态和提高杯状细胞数量,提高麻鸡肠道屏障完整性,并提高麻鸡抗氧化能力与免疫球蛋白的分泌水平。当饲料中葡甘露低聚糖添加量为0.5 g/kg,此时麻鸡法氏囊相对重量提高72.45%,显著提高麻鸡十二指肠黏膜中的超氧化物歧化酶(SOD)活性、降低丙二醛(MDA)含量、增强总抗氧化(T-AOC)能力,显著增强空肠黏膜中T-AOC,显著降低回肠黏膜中MDA含量,42 d麻鸡血清中的T-AOC从对照组的0.54U/m L提高到0.92U/m L,42 d麻鸡血清中s Ig A、Ig G和Ig M含量分别提高25%、34%和34%。(4)葡甘露低聚糖对大肠杆菌耐药性的影响研究表明,本研究中的大肠杆菌对四环素和恩诺沙星的耐药性最为严重,葡甘露低聚糖可有效提高耐药大肠杆菌的药敏性。当葡甘露低聚糖为5g/L时,恩诺沙星对大肠杆菌的最小抑菌浓度从对照组的8μg/m L降低到0.25μg/m L。葡甘露低聚糖对耐药大肠杆菌的抗性基因的表达有抑制作用,且对恩诺沙星抗性基因表达的抑制作用高于对四环素抗性基因的表达。当葡甘露低聚糖浓度为10g/L时,恩诺沙星抗性基因oqx AB的表达量仅为对照组的67%,说明葡甘露低聚糖可以干扰大肠杆菌的外排泵系统,阻止细菌排除抗生素,以此达到降低大肠杆菌耐药性的目的。综上所述,本文建立了重组β-甘露聚糖酶制备技术,并在此基础上建立了酶法定向水解魔芋葡甘露聚糖制备高纯度葡甘露低聚糖产品的技术。此外,通过麻鸡养殖实验与大肠杆菌耐药性实验表明,葡甘露低聚糖具有提高动物抗氧化和免疫能力的功效,并在降低动物体内微生物耐药性方面具有潜在应用价值。
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