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背景心血管疾病仍然是全球死亡的主要原因之一。心肌组织急性阻塞导致的缺血损伤而预后不良。虽然再灌注治疗是目前快速恢复冠状动脉血流至心肌的最有效治疗方法,但再灌注治疗时可能导致额外的心肌损伤。将外源性线粒体移植到缺血区替换受损的线粒体,是一种减缓心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion,IR）损伤和改善心脏功能的新疗法。目前在已报到的临床试验中和动物实验中,是通过单次注射外源性线粒体的方法缓解了心肌IR损伤。但研究显示在再灌注期间存在持续的线粒体功能障碍,线粒体功能的长期保护显得尤为重要。比起线粒体的单次给予,探究线粒体的多次缓慢释放对治疗心肌IR损伤后维持的长期疗效具有吸引力。水凝胶已被用于封装各种细胞和生物分子治疗心肌缺血性疾病,实现了生物制剂靶向释放和在有效区域的集中,是一种理想的生物载体。细胞外基质（extracellular matrix,ECM）水凝胶在注射到组织内后自身结构构成了天然细胞外环境,具有良好的生物相容性并能保留生物分子的结构和功能。此外,有研究证实线粒体被水凝胶封装后保存了功能活性,使外源性线粒体通过ECM水凝胶缓慢释放治疗心肌IR损伤具有理论依据和潜在的长期疗效。目的（一）分离出功能性的外源性线粒体,研究线粒体通过多次给予后对心肌细胞缺血缺氧损伤后功能代谢的影响。（二）制备出可注射性的ECM水凝胶。研究线粒体通过ECM水凝胶注射入心脏后释放的可行性。（三）研究通过水凝胶缓慢释放外源性线粒体的治疗方式,对心肌IR损伤后的心肌损伤、心脏修复和炎症调节的作用。方法1.心肌细胞和脂肪干细胞的培养:从Sprague-Dawley（SD）大鼠乳鼠中获取心室组织,被剪成1x1mm组织块,使用0.1%胰蛋白酶消化液消化获取新生大鼠心肌细胞（Neonatal rat cardiomyocytes,NRCMs）。通过过滤和去除成纤维细胞后,加入含双抗、20%胎牛血清（Fetal bovine serum,FBS）的DMEM培养基在含5%C02的37度恒温培养箱中培养。另外,脂肪干细胞是用SD大鼠的脂肪组织块通过组织贴壁法爬出细胞获取。2..外源性线粒体的分离和鉴定:根据市售的细胞线粒体分离试剂盒的操作协议,从大鼠脂肪干细胞中分离出外源性线粒体,使用标准筛过滤匀浆液提高线粒体的纯度。通过Mito Tracker Red CMXROS（线粒体红色荧光探针）染色检测线粒体的完整性,通过对线粒体进行线粒体膜电位染色（JC-1染色）后的流式细胞术分析检测线粒体的功能性。3.心肌细胞OGD/R模型的构建及实验干预:NRCMs加入无血清、无糖的DMEM培养基在缺氧培养箱中培养12小时,然后置换含20%FBS的高糖DMEM培养基在正常条件下培养12小时进行再氧合,构建氧气和葡萄糖剥夺/再灌注（Oxygen and glucose deprivation/reperfusion,OGD/R）模型。在给予等量的外源性线粒体条件下,在再氧合时分别1次给予或3次给予线粒体与NRCMs共培养处理。4.NRCMs能量代谢功能的检测:在体外,线粒体和NRCMs共同培养,然后通过荧光鬼笔环肽染色检测NRCMs对线粒体的摄取。给予线粒体移植治疗后,通过市售的三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）检测试剂盒检测各组的NRCMs产生的ATP值。通过市售的活性氧（Reactive oxygen species,ROS）荧光探针装载NRCMs后,分析荧光信号强度计算得到ROS的水平。5.ECM水凝胶的制备及特征检测:经过真空冻融和脱细胞处理后获取牛心包基质,通过胃蛋白酶液消化牛心包基质制备ECM水凝胶。在体外,通过多种细胞播种在ECM水凝胶表明上检测生物细胞相容性;在体内,通过皮下包埋后进行HE染色、免疫组化染色检测ECM水凝胶的生物相容性;通过皮下包埋后测量尺寸大小检测ECM水凝胶的生物降解性。6.线粒体通过ECM水凝胶注射入心脏后释放的可行性检测:在体内,将预先染色的线粒体单独或和ECM水凝胶共同注射进大鼠心室缺血区域后,通过组织切片的三色免疫荧光染色检测线粒体通过ECM水凝胶输注入心脏后释放的可行性。7.心肌缺血再灌注动物模型及实验干预:通过对SD大鼠左前降支近端阻断血流30分钟后使血运再通来构建心肌IR模型。再灌注期间,线粒体、ECM水凝胶或等量的两者混合物分别地通过注射到心肌缺血区完成实验干预。8.对心肌IR损伤后的保护作用的相关检测:在缺血恢复4周后,心肌IR损伤后的心肌修复的检测是通过对组织切片进行氯化三苯基四唑（Triphenyltetrazole chloride,TTC）染色、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）染色、Masson三色染色和免疫组化染色。另外,在缺血恢复1、3天收集血清后检测心肌肌钙蛋白I（Cardiac troponin I,c Tn I）和肌酸激酶同工酶MB（Creatine Kinase Isoenzyme-MB,CK-MB）的水平。在缺血恢复4周后收集血清检测炎症细胞因子如白介素-6（Interleukin-6,IL-6）、白介素-10（Interleukin-10,Interleukin-10）和肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）的水平。结果（一）外源性线粒体通过多次给予后对心肌细胞缺血缺氧损伤后的功能代谢的影响从脂肪干细胞中分离的线粒体,使用Mito-Traxker Red CMXROS标记下证实提取了形态完整,大小相似的线粒体。进一步使用线粒体膜电位检测试剂（JC-1）染色证实分离的外源性线粒体具有功能。通过使用鬼笔环肽的荧光染色和观察到的自主搏动证实分离和培养出NRCMs。线粒体与NRCMs一起共培养后被吸收到细胞质中。NRCMs在缺氧缺血损伤后,单次给予线粒和多次给予线粒体后均明显使心肌细胞缺氧缺血损伤后产生更多ATP和减少ROS的积累,另外,在给予总量相等的线粒体的条件下,多次给予线粒体比单次给予线粒体使心肌细胞缺血缺氧损伤后产生更多ATP和减少ROS的积累。（二）外源性线粒体通过ECM水凝胶注射入心脏后释放的可行性在体外,多种细胞在ECM水凝胶表明上播种后保持了良好的生存能力和生物细胞相容性。在体内,ECM水凝胶皮下包埋后具有生物降解性,且免疫组化染色证实ECM水凝胶中长入大量血管内皮和平滑肌细胞,是一种很有前景的生物载体。在体内,和线粒体单独注射相比,和ECM水凝胶一起混匀注射到左心室缺血区域后能使更多的线粒体滞留,且线粒体随着ECM水凝胶在体内降解逐渐释放到周围组织中,实现了线粒体的目的区域集中和缓慢释放。（三）外源性线粒体在ECM水凝胶缓慢释放后对心肌IR损伤后的保护作用首先,外源性线粒体单独注射或通过ECM水凝胶缓慢释放后使IR损伤1和3天后血清中的c Tn I和CK-MB均显着比载体组降低,线粒体移植有效缓解了IR后的心肌损伤。其次,与载体和线粒体组相比,外源性线粒体在水凝胶缓慢释放后对心肌IR损伤28天后的心脏显着降低了心肌缺血区域范围和梗死面积,同样地减少在缺血区纤维化的形成,增加了缺血区新生血管形成的数量,减少缺血区心肌细胞的凋亡。这些促进了心脏IR损伤后心脏的修复。最后,与载体和线粒体组相比,外源性线粒体在水凝胶缓慢释放后使心肌IR损伤28天后血清中的促炎细胞因子IL-6和TNF-α水平显著下降,而使抗炎细胞因子IL-10水平显著升高。表明了线粒体通过ECM水凝胶缓慢释放后缓解炎症的发生。结论总的来说,外源性线粒体移植的治疗方法使心肌细胞缺血缺氧损伤后产生更多ATP和减少ROS的积累,而在给予总量相等的线粒体的条件下,多次给予线粒体比单次给予线粒体使心肌细胞缺血缺氧损伤后的能量代谢得到改善。另外,线粒体和ECM水凝胶一起混匀注射到心肌缺血区后,具备实现线粒体的靶向释放和有效区域线粒体集中的可行性。最重要的是,在大鼠心肌缺血再灌注模型中,通过水凝胶缓慢释放线粒体比单独的线粒体移植疗法减轻心肌损伤,促进心脏修复,缓解炎症的发生。总体而言,通过水凝胶缓慢释放线粒体对心肌IR损伤具有长期保护治疗作用。