结核分枝杆菌亚单位疫苗A1D4/MTO免疫原性及保护性研究

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[目的]卡介苗(Bacille Calmette-Guerin, BCG)接种范围广,但免疫保护期短,对潜伏感染人群和成人缺乏有效的保护力。研究针对BCG免疫后的未感染人群或潜伏感染人群的新型疫苗,已成为结核病防控的当务之急。依据结核分枝杆菌的致病性及其表达抗原谱具有的阶段特异性,我们在本研究中首先采用基因工程技术表达纯化阶段性抗原。拟利用全血干扰素释放分析技术(Whole-blood IFN-γ release assay, WBIA),比较不同抗原刺激中国M.tb感染者外周血分泌IFN-γ浓度的差异、以鉴定这些抗原是否可被中国M.tb感染者的细胞免疫识别,有助于筛选靶向M.tb感染后不同时期所表达的优势抗原,以利于新型疫苗的研制。然后,结合机体抗M.tb保护性的免疫机制、临床试验和应用的不同佐剂及其组分的特性,我们拟建立一种新型佐剂MTO。最后,拟构建包含M.tb多阶段靶抗原的融合蛋白A1D4,并联合佐剂MTO免疫小鼠,评价该亚单位蛋白疫苗的免疫原性和保护性。[方法]1、蛋白原核表达和纯化: M.tb对数生长期分泌的保护性抗原(Ag85B)和潜伏期高表达的靶抗原(Rvl813, Rv2660c, Rv2623, HspX),以及以此为基础建立的融合蛋白A1D4,构建相应的重组原核表达质粒,并进行原核表达纯化、SDS-PAGE和Western blotting鉴定。2、评价A1D4和各亚组分蛋白是否被中国M.tb感染人群识别:先依据相应的临床诊断标准对受试人群进行初筛,区分为结核病患者、潜伏感染者(Latent tuberculosis infection, LTBI)和未感染者人群;再结合本实验室建立的rCM-WBIA技术及前期工作中公开发表的标准,确定中国M.tb高流行区的感染人群和未感染人群,以排除BCG免疫后影响。然后以WBIA技术检测和比较A1D4和各亚组分蛋白在不同人群中诱导抗原特异性IFN-γ的水平。3、亚单位蛋白疫苗的制备和免疫:将100μl MTO与100μl浓度为0.2μg/μl的A1D4蛋白混和,即得到A1D4/MTO亚单位疫苗。动物:SPF级C57BL/6小鼠。免疫途径:皮下注射。免疫分组:BCG阳性对照组,剂量为1.67×106CFU/200μl,免疫1次;阴性对照组PBS或MTO对照组;实验组A1D4/MTO组,单次注射200μl,每3周皮下免疫1次,共3次。4、亚单位蛋白疫苗的免疫原性分析:免疫9周后,处死小鼠,收集血清和脾细胞,进行免疫原性分析。(1)评价体液免疫应答:ELISA检测小鼠血清中A1D4特异性的抗体总IgG及亚类IgG1、IgG2a的水平。(2) ELISA检测A1D4抗原特异性的TNF-α、IFN-γ及IL-2水平,以PPD刺激为阳性对照,RPMI1640为阴性对照。5、流式细胞仪(FCM)结合胞内因子染色法(ICS)分析A1D4抗原特异性的CD4+T和CD8+T细胞中分泌TNF-α+、IFN-γ+、IL-2+细胞总数,进一步分析单阳、双阳和三阳性多功能CD4+T和CD8+T细胞。以PPD刺激为阳性对照,RPMI1640为阴性对照。6、亚单位蛋白疫苗的免疫保护性分析:免疫C57BL/6小鼠9周后,尾静脉注谢M.tbH37Rv毒株(1.2×106CFU/只)攻击感染。感染4周后,分别检测小鼠肺脏和脾脏的细菌载量以及病理改变,观察短期存活率。[结果]1、蛋白表达纯化和鉴定:SDS-PAG和Western blotting证实原核表达纯化的A1D4蛋白及其亚组分蛋白具有较高的纯度和生物学活性。2、筛选抗原均可被中国M.tb感染人群T细胞所识别:各单个亚组分蛋白在M.tb为感染人群中刺激产生的抗原特异性IFN-γ浓度均显著高于未感染人群(P<0.05)。融合蛋白A1D4可诱导M.tb感染人群产生更高水平的A1D4特异性IFN-γ (P<0.05),且高于单个亚组分蛋白水平。3、A1D4蛋白/MTO诱导产生显著高水平的A1D4特异性IgG抗体及其亚类,趋向于Thl型免疫应答。4、A1D4蛋白/MTO诱导产生抗原特异性的细胞免疫应答:(1)亚单位疫苗A1D4/MTO免疫小鼠脾细胞分泌高水平的A1D4抗原特异性的细胞因子IFN-γ,TNF-α和IL-2。(2)无论用PPD或特异抗原A1D4刺激,A1D4/MTO组小鼠脾脏分泌最多数量的总IFN-y+CD4+和CD8+T细胞,且相对于PBS组和MTO组明显上升(P<0.05);A1D4/MTO组针对PPD刺激的总TNF-α分泌型CD4+T细胞数,以及针对A1D4刺激的总TNF-α分泌型CD4+T和CD8+T细胞数均显著性高于PBS组和MTO组。进一步分析多功能T细胞数量,A1D4/MTO组A1D4特异性IFN-y+单阳和IFN-γ+IL-2+双阳CD4+T细胞,分别显著高于MTO组和PBS组(P<0.05);以及IFN-γ+单阳、IFN-γ+IL-2+双阳、IFN-γ+TNF-α+双阳和IFN-γ+IL-2+TNF-α+三阳性CD8+T细胞数,均相对于PBS组显著性升高(P<0.05)。甚至,IFN-γ+单阳和IFN-γ+TNF-α+双阳CD8+T细胞数量,相对于BCG组也显著增加。5、免疫保护性:与PBS免疫小鼠相比,A1D4蛋白/MTO组小鼠的肺脏荷菌量显著降低(p=0.001);病理变化更轻微;肺脏切片有少量抗酸杆菌,短期存活率达83.33%。6、佐剂MTO的特性:与PBS免疫小鼠相比,MTO组免疫提供一定程度的非特异保护性,肺脏荷菌量显著降低(P<0.05),病理变化相当,短期存活率达83.33%。MTO免疫小鼠脾细胞产生针对PPD或A1D4蛋白反应性高水平的TNF-α;和IL-2,PPD反应性总IFN-γ分泌型CD8+T细胞数,A1D4蛋白特异性总IFN-γ分泌型或总TNF-α分泌型CD4+和CD8+T细胞数,以及A1D4蛋白特异性IFN-γ+单阳CD8+T细胞数均较PBS组显著升高。[结论]以中国M.tb感染人群可免疫识别的,M.tb在感染后不同阶段表达的免疫优势抗原Ag85B,Rv1813,Rv2660c,Rv2623和HspX为基础,建立亚单位疫苗A1D4/MTO,免疫小鼠能提供显著的抗结核分枝杆菌急性感染的保护性,尽管其保护性不及BCG。其保护性主要与其诱导产生的A1D4抗原特异性的CD4+Th1型应答相关,尤其是与具体包括A1D4抗原特异性分泌IFN-γ+IL-2+双阳CD4+T细胞数量,以及IFN-γ+单阳、IFN-γ+IL-2+双阳、IFN-γ+TNF-α+双阳和IFN-γ+IL-2+TNF-α三阳性CD8+T细胞数量的显著增加有关。另外,A1D4抗原特异性IFN-γ+单阳和IFN-γ+TNF-α+双阳CD4+T细胞、以及IFN-γ+单阳和IFN-γTNF-α+双阳CD8+T细胞数量显著增加,表明该蛋白疫苗具备弥补BCG的免疫效应的不足的特性。本研究为进一步评价该疫苗在动物模型中作为BCG初免后的增强型疫苗的效果奠定了基础。
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