论文部分内容阅读
牛结核病(Bovine Tuberculosis, bTB)是一种严重危害养牛业的、慢性消耗性人兽共患病,主要由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis, M. bovis)感染所致。同时,牛分枝杆菌是人结核病的重要致病因子之一,野生动物是牛结核分枝杆菌重要的储存宿主。目前国内外控制家畜和野生动物结核病普遍采用“检疫-扑杀”的措施,因此,准确及时的诊断结核病对有效控制该病、保障动物和人类健康显得极为重要。目前法定的牛结核检疫方法是结核菌素皮内变态反应(Tuberculin skin test, TST),由于TST具有劳动强度大、操作复杂、费时、与卡介苗和非结核分枝杆菌等具有交叉反应等缺陷,牛结核病检测需要探索更加灵敏快速的检测方法。发达国家的实践也证实,控制或根除牛结核病非常有必要依靠实验室检测方法。
国际兽疫局(OIE)也推荐使用皮试以外的方法,如IFN-y体外释放法、抗体检测法等。这些方法的关键之一就是选择灵敏特异的刺激抗原或诊断抗原。牛分枝杆菌感染机体过程中分泌多种抗原,使用单个抗原检测其抗体水平或刺激IFN-y体外释放时灵敏度较低。研究证明,“鸡尾酒”诊断方法能提高诊断的敏感性,但使用多种蛋白抗原存在生产费时费力,使用时配比不均,难于进行标准化生产等问题。鉴于以上原因,本研究对三种RDl区缺失基因Rv3872、CFP10和ESAT6进行了融合表达Rv3872-CFP10-ESAT6(RCE)三蛋白,该蛋白可以区分卡介苗与毒力型结核分枝杆菌与牛分枝杆菌,并将Rv3872基因插入70-83-CE蛋白基因的前面,融合表达了Rv3872-MPB70-MPB83-CFP10-ESAT6(R5)五蛋白,旨在为牛结核病临床诊断提供更加敏感、特异的诊断抗原。同时,建立了RCE间接ELISA方法,制备了RCE-胶体金试纸条并进行了初步应用。
本研究的主要内容如下:
1.两种融合蛋白表达载体的构建、抗原的表达纯化克隆了牛结核分枝杆菌RD1区基因Rv3872,构建了原核表达载体pET-28a-RCE和pET-28a-Rv3872-70-83-CE,诱导表达融合蛋白,并用亲和层析法进行纯化,得到了纯度较高的RCE蛋白,但R5蛋白在纯化时遇到困难,无法去除大部分杂带,这可能与串联基因过多有关。
2.两种融合蛋白特性分析ELISA和Western blot分析显示:两种融合蛋白均能与牛结核分枝杆菌阳性血清发生特异性反应,而与牛副结核病、牛布氏杆菌病、牛巴贝斯病和牛传染性鼻气管炎病阳性血清不反应。热稳定性试验证明两种融合蛋白热稳定性相似,在超过60℃温度处理一小时后,活性迅速降低。两种融合蛋白初步应用于ELISA,分别与本实验室克隆表达的CE蛋白和70-83-CE比较,结果显示,融合蛋白RCE比CE蛋白有更高的敏感性,而R5蛋白则可能由于串联的基因过多,各蛋白结构域互相覆盖部分抗原位点,导致敏感性远低于四联蛋白。说明RCE蛋白作为一种新型的诊断抗原具有良好的应用前景。
3.RCE蛋白间接ELISA方法的建立和胶体金试纸条的制备通过方阵滴定,确定RCE-ELISA最佳工作条件:抗原的最佳包被浓度为15.625ng/mL,封闭液为5％的脱脂奶粉。一抗1:100倍(体积比)稀释,酶标二抗1:10000倍(体积比)稀释,滴加底物液反应10分钟后0.25％HF终止显色。RCE-胶体金试纸条最佳制备条件:抗原标记胶体金的最佳pH值为8.0,每毫升胶体金溶液中抗原最适标记量为224μg。检测线最佳抗原包被浓度为1.4mg/mL,质控线最佳IgG包被浓度为3.0mg/mL。交叉试验证明试纸条不与牛的其它非相关疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性。检测同一份阳性牛血清进行比较实验,结果RCE-胶体金试纸条的敏感性比进口试纸条高4倍,证明其敏感性显著高于进口试纸条。
4.RCE蛋白间接ELISA和胶体金试纸条在临床牛结核检测中的应用使用RCE-间接ELISA方法检测323份临床牛血清样本,其中TST阳性和阴性样本各为119和204份。ELISA和TST总符合率达到79.57％。RCE较CE蛋白的TST阳性符合率提高了18.49％;RCE-间接ELISA较CE-间接ELISA多检出阴性样本26份,比CE蛋白的TST阴性符合率提高了12.74％;说明RCE-间接ELISA较CE-间接ELISA具有更高的灵敏度与特异性。用RCE-胶体金试纸条检测301份牛血清,与进口试纸条比较,阳性符合率达到97.78％(88/89),阴性符合率达到95.91％(211/220),总符合率为96.45％(299/310)。说明本研究中的RCE-胶体金试纸条与国际上同类产品具有相似的灵敏度和特异性。检测了468份鹿血清,RCE蛋白比CE蛋白多检出阳性样本6份,阳性率提高了1.28％。RCE胶体金试纸条检测100份鹿血清,其中包括RCE-ELISA检出阳性9份,91份为抗体阴性。RCE-胶体金试纸条共检出阳性样本5份,阳性率5％,试纸条敏感性略低于ELISA(9％)。
5.RCE蛋白间接ELISA方法和胶体金试纸条在人结核病检测中的应用使用RCE-ELISA方法,检测32份结核病人血清,RCE-ELISA和CE-ELISA均检出阳性样本为25份,阳性符合率均为78.13％(25/32)。检测22份IFN-γ阳性人血清,RCE-ELISA和CE-ELISA均检出阳性样本为18份,阳性率81.82％(18/22)。从结果中可以看出,RCE-ELISA在人结核分枝感染中具有重要的应用价值。
国际兽疫局(OIE)也推荐使用皮试以外的方法,如IFN-y体外释放法、抗体检测法等。这些方法的关键之一就是选择灵敏特异的刺激抗原或诊断抗原。牛分枝杆菌感染机体过程中分泌多种抗原,使用单个抗原检测其抗体水平或刺激IFN-y体外释放时灵敏度较低。研究证明,“鸡尾酒”诊断方法能提高诊断的敏感性,但使用多种蛋白抗原存在生产费时费力,使用时配比不均,难于进行标准化生产等问题。鉴于以上原因,本研究对三种RDl区缺失基因Rv3872、CFP10和ESAT6进行了融合表达Rv3872-CFP10-ESAT6(RCE)三蛋白,该蛋白可以区分卡介苗与毒力型结核分枝杆菌与牛分枝杆菌,并将Rv3872基因插入70-83-CE蛋白基因的前面,融合表达了Rv3872-MPB70-MPB83-CFP10-ESAT6(R5)五蛋白,旨在为牛结核病临床诊断提供更加敏感、特异的诊断抗原。同时,建立了RCE间接ELISA方法,制备了RCE-胶体金试纸条并进行了初步应用。
本研究的主要内容如下:
1.两种融合蛋白表达载体的构建、抗原的表达纯化克隆了牛结核分枝杆菌RD1区基因Rv3872,构建了原核表达载体pET-28a-RCE和pET-28a-Rv3872-70-83-CE,诱导表达融合蛋白,并用亲和层析法进行纯化,得到了纯度较高的RCE蛋白,但R5蛋白在纯化时遇到困难,无法去除大部分杂带,这可能与串联基因过多有关。
2.两种融合蛋白特性分析ELISA和Western blot分析显示:两种融合蛋白均能与牛结核分枝杆菌阳性血清发生特异性反应,而与牛副结核病、牛布氏杆菌病、牛巴贝斯病和牛传染性鼻气管炎病阳性血清不反应。热稳定性试验证明两种融合蛋白热稳定性相似,在超过60℃温度处理一小时后,活性迅速降低。两种融合蛋白初步应用于ELISA,分别与本实验室克隆表达的CE蛋白和70-83-CE比较,结果显示,融合蛋白RCE比CE蛋白有更高的敏感性,而R5蛋白则可能由于串联的基因过多,各蛋白结构域互相覆盖部分抗原位点,导致敏感性远低于四联蛋白。说明RCE蛋白作为一种新型的诊断抗原具有良好的应用前景。
3.RCE蛋白间接ELISA方法的建立和胶体金试纸条的制备通过方阵滴定,确定RCE-ELISA最佳工作条件:抗原的最佳包被浓度为15.625ng/mL,封闭液为5％的脱脂奶粉。一抗1:100倍(体积比)稀释,酶标二抗1:10000倍(体积比)稀释,滴加底物液反应10分钟后0.25％HF终止显色。RCE-胶体金试纸条最佳制备条件:抗原标记胶体金的最佳pH值为8.0,每毫升胶体金溶液中抗原最适标记量为224μg。检测线最佳抗原包被浓度为1.4mg/mL,质控线最佳IgG包被浓度为3.0mg/mL。交叉试验证明试纸条不与牛的其它非相关疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性。检测同一份阳性牛血清进行比较实验,结果RCE-胶体金试纸条的敏感性比进口试纸条高4倍,证明其敏感性显著高于进口试纸条。
4.RCE蛋白间接ELISA和胶体金试纸条在临床牛结核检测中的应用使用RCE-间接ELISA方法检测323份临床牛血清样本,其中TST阳性和阴性样本各为119和204份。ELISA和TST总符合率达到79.57％。RCE较CE蛋白的TST阳性符合率提高了18.49％;RCE-间接ELISA较CE-间接ELISA多检出阴性样本26份,比CE蛋白的TST阴性符合率提高了12.74％;说明RCE-间接ELISA较CE-间接ELISA具有更高的灵敏度与特异性。用RCE-胶体金试纸条检测301份牛血清,与进口试纸条比较,阳性符合率达到97.78％(88/89),阴性符合率达到95.91％(211/220),总符合率为96.45％(299/310)。说明本研究中的RCE-胶体金试纸条与国际上同类产品具有相似的灵敏度和特异性。检测了468份鹿血清,RCE蛋白比CE蛋白多检出阳性样本6份,阳性率提高了1.28％。RCE胶体金试纸条检测100份鹿血清,其中包括RCE-ELISA检出阳性9份,91份为抗体阴性。RCE-胶体金试纸条共检出阳性样本5份,阳性率5％,试纸条敏感性略低于ELISA(9％)。
5.RCE蛋白间接ELISA方法和胶体金试纸条在人结核病检测中的应用使用RCE-ELISA方法,检测32份结核病人血清,RCE-ELISA和CE-ELISA均检出阳性样本为25份,阳性符合率均为78.13％(25/32)。检测22份IFN-γ阳性人血清,RCE-ELISA和CE-ELISA均检出阳性样本为18份,阳性率81.82％(18/22)。从结果中可以看出,RCE-ELISA在人结核分枝感染中具有重要的应用价值。