第一部分人骨关节炎软骨细胞体外培养与鉴定[目的]体外培养并扩增人骨关节炎软骨细胞,并对培养的软骨细胞进行鉴定,为后续实验奠定基础。[方法]收集确诊为骨关节炎(Osteoarthritis,OA)行膝关节置换术患者的软骨组织块,采用胰酶联合Ⅱ型胶原酶两步消化法体外培养人骨关节炎软骨细胞。第1 代(Passage1,P1) OA 软骨细胞培养第 1、2、4、6、8、10、12 天时,MTT检测软骨细胞生长曲线。P1代细胞培养2天时,采用甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色鉴定软骨细胞,Annexin V/PI凋亡试剂盒染色细胞并用流式细胞仪检测细胞凋亡率。[结果] (1)OA软骨原代细胞形态为小多角形,胞膜伸展,折光性好,软骨细胞聚集成生发中心呈铺路石样,软骨细胞生长较慢,至14-18天时方可长满培养瓶;传代后细胞形态逐渐增大,细胞触角增多,胞膜伸展变宽,细胞形态呈宽大扁平状,折光性降低,细胞增殖缓慢。(2)MTT检测后发现,P1代软骨细胞在1-3天为细胞增殖潜伏期,4-8天为对数生长期,10天以后为平台期,整个生长曲线呈“S”状。(3)甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色见所培养细胞均为阳性染色,提示培养细胞为软骨细胞。(4) P1代软骨细胞培养2天时,流式细胞仪检测提示软骨细胞早期凋亡率小于5%。[结论](1)人OA软骨细胞生长较慢。(2) P1代OA软骨细胞活力好,可用于相关实验研究。(3) P1代软骨细胞培养2天时,加药干预并进行实验研究比较理想。第二部分三种拮抗剂阻断SDF-1/CXCR4信号通路对OA软骨细胞生物学效应的影响[目的]观察三种拮抗剂(TN14003、T140、AMD3100)靶向阻断SDF-1/CXCR4信号通路对OA软骨细胞生物学影响,为探寻高效安全的OA靶向药物奠定体外实验基础。[方法]P1代OA软骨细胞随机分成A、B、C、D四组,A、B、C三组预先分别加入1000nmol/L的TN14003、T140、AMD3100拮抗剂1小时,然后四组同时加入100ng/ml的SDF-1。加药干预后10天,光镜下大体观察四组细胞形态学变化;第10天时,行Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色,观察各组OA软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白表达;第1、2、4、6、8、10天时,MTT分别检测四组软骨细胞增殖情况;2天后,流式细胞仪检测四组软骨细胞凋亡情况;第2、4、6、8、10天时,ELISA法检测四组软骨细胞培养基中基质金属蛋白酶3,9,13(MMP-3,MMP-9,MMP-13)含量,q-PCR检测四组软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖mRNA的表达,Western blot检测四组软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白的蛋白水平表达。[结果](1)光镜下见四组OA软骨细胞形态未见明显差异及异常。(2) Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色后发现,A组内细胞核周围胞质内棕黄色染色最深,B、C、D三组染色依次变浅。(3) MTT检测结果提示,四组细胞增殖趋势比较接近,四组细胞OD值同一时间点比较未见明显差异(P>0.05)。(4)加药干预2天后,流式细胞仪检测结果示四组细胞凋亡率无明显差异(P>0.05)。(5) ELISA检测后发现,四组细胞分泌至培养基中MMP-3、MMP-13的含量随着培养时间延长而逐渐增高,其中以加药前6天分泌量较多,6天以后分泌量明显减少。同一时间点比较,A组细胞分泌的MMP-3、MMP-13含量最少,A、B、C、D四组含量依次递增,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。四组培养基中MMP-9因含量过低未能被检测到。(6) q-PCR提示,四组软骨细胞内Ⅱ型胶原蛋白(ColⅡ)及聚集蛋白聚糖(ACAN) mRNA表达量随着培养时间延长而逐渐下降,但A组表达量下降较其它组慢。同一时间点比较,A、B、C、D四组表达量依次递减,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。(7) Western Blot检测四组软骨细胞内Ⅱ型胶原蛋白后的灰度值提示,随着药物干预时间延长,四组灰度值逐渐降低,但A组灰度值较其它组下降最慢。同一时间点比较,A、B、C、D四组灰度值依次递减,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。[结论](1)浓度为1000nmol/L的TN14003、T140、AMD3100对OA软骨细胞生长与增殖无明显影响。(2) TN14003、T140、AMD3100均可减少OA软骨细胞分泌 MMP-3、MMP-13,其中以 TN14003 减少最明显。(3)TN14003、T140、AMD3100均可上调OA软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖mRNA的表达量,而TN14003上调最显著。(4) TN14003、T140、AMD3100均可延缓OA软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白降解,其中以TN14003延缓最显著。第三部分计算机模拟三种拮抗剂与CXCR4分子期靶点对接研究[目的]采用计算机模拟对接技术,深入研究CXCR4拮抗剂(TN14003、T140、AMD3100)与CXCR4的作用靶点及机理,找到它们与CXCR4相互作用的核心基团,为这3种小分子药物探针设计及结构优化打下基础。[方法](1)在PDB晶体数据库检索CXCR4的晶体结构并用Discovery Studios软件进行结构优化。(2)运用ChemDraw15.0软件构建T140、TN14003和AMD3100分子结构,并将相应结构导入SYBYL-X2.0软件进行结构优化。(3)选用GOLD5.2.2对接软件模拟TN4003、T140、AMD3100与膜蛋白受体CXCR4的结合模式,得出TN4003、T140及AMD3100的药效基团并进行打分。(4)利用Discovery Studio 4.5 visualize和Pymol等软件对分子对接结构进行结合模式和相互作用的可视化分析。[结果](1) TN14003与CXCR4形成氢键的位点为:Arg2、Nal3、Cys4、Tyr5、Cit6、Arg11、Cit12。(2) T140与CXCR4形成氢键的位点为:Arg1、Arg2、Nal3、Cys4、Tyr5、Arg6、Tyr10、Arg11、Cit12。(3) AMD3100与CXCR4形成氢键的的位点为:AMD3100其中一个四氮杂环的第4、8位氮基团和另一个四氮杂环的第4位氮基团。(4) CXCR4与TN14003、T140形成氢键的主要核心位点分别是Ser178、Glu32、Gln272和Asp262、Asp187、Asp193; CXCR4与AMD3100形成氢键的主要核心位点是Arg188、Asp187、Asp97。(5) TN14003、T140、AMD3100与CXCR4形成的氢键数目分别为13、12、4个;TN14003、T140、AMD3100与CXCR4分子对接得分分别为:120.35、110.43、62.69。[结论](1)计算机对接模拟技术可以较好地预测小分子药物的药效基团及其配体的具体作用靶点。(2) TN14003及T140的第7、8位氨基酸为非核心基团,AMD3100的其中一个四氮杂环的第8位氮基团为非核心基团。(3) TN14003、T140、AMD3100与受体分子CXCR4结合强弱依次是:T1N14003>T140>AMD3100。第四部分基于计算机模拟的小分子探针设计与生物学特性研究[目的]设计合成TN14003、T140和AMD3100小分子光亲和标记探针,予以生物学验证具体作用靶点,探索它们的作用机理,并为将来这3种拮抗剂的结构优化打下前期理论基础。[方法] (1)在不改变药效基团的前提下进行TN14003、T140及AMD3100光亲和标记探针的设计,以对苯甲酰基-L-苯丙氨酸(Bpa)作为共价结合基团、聚乙二醇(PEG)为连接基团及生物素(Biotin)作为报告基团,连接在这3种小分子药物的非药效基团上。(2) TN14003、T140及AMD3100光亲和标记探针进行软骨细胞光交联实验以明确这3种小分子药物的作用部位。(3)通过趋化实验比较TN14003、T140、AMD3100及其相应探针的拮抗效率变化。[结果](1)成功设计并合成TN14003、T140及AMD3100光亲和标记探针。(2)荧光显微镜下可以看到TN14003、T140及AMD3100探针在细胞膜部位显示清晰的绿色荧光信号。(3)在拮抗SDF-1诱导的软骨肉瘤细胞趋化实验中,3种小分子药物与其相应探针的穿膜细胞数比较未见明显差异(P>0. 05)。[结论](1) TN14003、T140、AMD3100小分子药物作用部位为细胞膜。(2)TN14003、T140、AMD3100制备成相应光亲和标记探针后对这3种小分子药物的拮抗效率未见明显影响。