论文部分内容阅读
气候变化导致水涝灾害在全球范围内频繁发生,加之大多数农作物(例如豌豆)属于水涝敏感型植物,水涝灾害最终导致农作物产量明显下降以至绝收。这主要是因为水涝环境限制了空气尤其是氧气(O2)和二氧化碳(C02)的流动,使得植物细胞正常的光合作用和呼吸作用受阻。同时,大量有毒代谢产物在细胞中积累最终造成细胞死亡。硫化氢(H2S)作为一种新型气体信号分子参与动植物细胞的多种生物学过程,并作为02感受器调控动物细胞低氧胁迫应答反应,但至今尚无H2S参与植物细胞应答水涝低氧胁迫方面的报道。本研究以建立了完善水培体系的豌豆以及H2S代谢途径拟南芥突变体desl-1(L-cysteine desulfhydrase)为材料,通过生理生化、细胞和分子生物学多种技术在分子水平上研究了H2S缓解水涝低氧胁迫造成的植物细胞死亡的分子机制。主要研究结果如下：1、Evans Blue染色发现水涝低氧胁迫最先导致根尖过渡区(TZ)细胞死亡,且DAB(显示过氧化氢,H202)和NBT(显示超氧根离子,O2·-)组织化学染色显示ROS首先在TZ细胞中大量积累,表明根尖TZ细胞可能是感知水涝低氧胁迫最敏感的部位。2、豌豆幼苗经外源H2S(由NaHS水解产生)预处理后进行水涝低氧胁迫处理,通过Evans Blue染色观察发现NaHS预处理明显缓解了水涝低氧胁迫造成的根尖细胞死亡。同时,DAB和NBT组织化学染色发现NaHS预处理明显降低了ROS在TZ细胞中的积累。3、在NaHS预处理和水涝低氧胁迫处理阶段添加内源H2S合成酶抑制剂HA(hydroxylamine),可明显影响根尖内源H2S含量。Evans Blue染色显示根尖细胞死亡程度与内源H2S含量密切相关,表明H2S可能参与了植物细胞对水涝低氧胁迫的应答过程。4、NaHS预处理对乙醇发酵途径关键酶PDC (pyruvate decarboxylase)和ADH(alcohol dehydrogenase)的活性影响不显著,但明显增加了GSH(glutathione)的含量以及APX (ascorbate peroxidase)的活性,表明H2S主要是通过提高植物细胞抗氧化系统活性增强其耐受水涝低氧胁迫的能力。5、通过H2S和NO (nitric oxide)特异性荧光染料染色观察,发现NaHS预处理可明显增加拟南芥野生型内源H2S和NO含量；而突变体des1-1中H2S和NO含量明显低于野生型；Evans Blue染色结果也表明desl-1耐受水涝低氧胁迫能力明显低于野生型,表明H2S与NO相互作用共同调控植物细胞水涝低氧胁迫应答反应。6、基因DESl的突变明显影响了N-end rule途径中标志基因ATE1 (Arg-tRNA transferase), ATE2, PRT6 (proteolysis), HRE1 (hypoxia responsive), HRE2, RAP2.12 (related to AP2.12), PCO1 (plant cysteine oxidase)和PC02的表达量,表明H2S通过影响N-end rule途径关键基因的表达参与植物细胞对低氧水平的感知；同时DES1的突变也明显影响了ER stress标志基因bZIP17 (basic domain/leucine zipper), bZIP28, bZIP60, BiP (bindingprotein), TIN(tunicamycin induced)和ERO (ER oxidoreductase)的表达量,表明H2S通过影响蛋白质的正确折叠来调控水涝低氧胁迫引起的细胞死亡。7、NaHS预处理明显抑制了豌豆根尖细胞乙烯的产生和ACC氧化酶(ACC oxidase, ACO)活性。此外,基因DES1的突变明显上调了拟南芥突变体desl-1中乙烯受体基因ETR2 (ethylene receptor)的表达。结合Evans Blue染色以及根长测定结果,表明H2S通过抑制乙烯的合成和感知途径启动了静止生长策略,以降低水涝低氧胁迫下能量的过度消耗。8、为了进一步揭示H2S参与水涝低氧胁迫应答和调控细胞死亡的生理和分子机制,我们构建了H2S代谢途径关键基因OAS-Al(O-acetyl-L-serine(thiol)lyase)和DESl的35S启动子、自身启动子过表达载体以及RNAi载体,并成功转化到农杆菌GV3101中,以期获得OAS-Al和DES1过表达和RNAi转基因植株,并对这些转基因植株的水涝低氧胁迫耐受性进行分析。综上所述,H2S通过与NO、ROS以及植物激素乙烯等相互作用,共同调控植物细胞对水涝低氧胁迫的应答过程,最终缓解水涝低氧胁迫引起的植物细胞死亡。本研究不仅具有重要科学意义,同时还为提高农作物耐受水涝低氧胁迫提供新的研究思路。