全球人口老龄化的加剧,老年健康问题受到高度关注。老年人随着年龄增长,身体机能退化、营养不平衡,需要摄入比人体推荐量更多的蛋白以满足机体的正常功能。并且,高蛋白膳食有助于改善肥胖、糖尿病等疾病。但过高的蛋白摄入会影响老年人肝肾和胃肠道正常的代谢功能。如何在提高老年人高蛋白摄入的同时,保证其充分的消化吸收而不影响正常的健康,显得极为重要。本课题组创新性将桑叶(Morus alba L.)和魔芋(Amorphophallus rivieri)两种天然、安全的农产食品原料结合,开发了一种以魔芋和桑叶为主要原料复配的固体饮料(本文中简称―复配粉‖),该产品能有效改善老年人对动物源性高蛋白膳食的消化,但其作用效果和机理还未明确。为了探讨上述科学问题,以15月龄BALB/c老年小鼠为受试动物,以饲喂AIN-93M标准日粮为正常对照,饲喂动物源性高蛋白(以AIN-93M标准日粮为基础,用动物蛋白替代部分玉米淀粉构成,蛋白质含量达50%以上。本文中简称―高蛋白‖)饲料的同时分别灌胃消食片和不同剂量的复配粉,探究复配粉对高蛋白膳食代谢作用的影响机理,为老年人群蛋白质科学膳食提供理论指导和实际应用。主要研究结果如下:(1)复配粉对高蛋白膳食老年小鼠蛋白质代谢作用的影响首先测定各试验组动物体重、摄食量、脏器指数、粪便和盲肠内容物的含水量及pH值,再采用生化试剂盒测定动物粪便的蛋白质表观消化率及与蛋白质代谢相关的血清生化指标,进而通过氨基酸靶标代谢组学和多肽组学,测定动物粪便中25种氨基酸含量和多肽序列,研究不同剂量复配粉对蛋白质消化性及其代谢产物的影响。结果表明,各试验组动物体重和脏器指数无显著性差异,摄食量随时间的延长高蛋白组有降低趋势。复配粉使高蛋白膳食老年小鼠盲肠内容物和粪便含水量增大,pH降低。蛋白质表观消化率在复配粉干预后均显著提高,高牛肉蛋白组表观消化率由86.70%提高到92.92%以上,且呈剂量关系;高鱼肉蛋白组由89.60%提高到96.78%以上。血清中GPT、GOT活性和氨基酸水平在复配粉干预下均提高,血清尿素氮含量降低,且效果优于消食片组。复配粉和消食片的干预显著性降低了高蛋白膳食粪便中氨基酸含量,特别是BHD组总氨基酸含量为2084 nmol/g,与NC组含量2049 nmol/g无显著性差异,提示复配粉促进了机体蛋白质的吸收,且对高鱼肉蛋白膳食的影响更明显。消食片虽能促进蛋白质的消化,但大部分以尿素氮的形式排出体外。粪便多肽鉴定结果表明,牛肉蛋白组共鉴定到1326条肽段,肽段分子量在3000 Da以下占93%,主要分布在1000~1500 Da,各试验组特有肽段数量分别为48、154、123、78、70、62条。鱼肉蛋白组共鉴定到194条肽段,分子量在3000 Da以下占93%,主要分布在1000~1500 Da,各试验组特有肽段数分别为14、24、15、14、15、17条。复配粉干预使各组特有肽段数减少,说明蛋白质降解更为彻底。通过肽段序列定位分析及功能预测发现,鉴定到的高丰度肽段主要源自肌动蛋白、肌球蛋白和少量的肌红蛋白、组蛋白。这4种蛋白大部分氨基酸在序列末端保守性较强,大多数肽段被鉴定出来,且可信度较高,C端以赖氨酸、苏氨酸等极性氨基酸为主要,N端以蛋氨酸、丙氨酸等非极性氨基酸和少量半胱氨酸、天冬氨酸等极性氨基酸为主,导致其不易被消化。以上结果说明复配粉促进了高蛋白膳食老年小鼠蛋白质消化代谢作用。(2)复配粉对高蛋白膳食老年小鼠胃及肠道组织形态的影响从动物肠道内环境结构入手,采用全肠道病理切片观察技术,就复配粉对高蛋白膳食老年小鼠胃及肠道健康的影响进行全面探索。包括胃和全肠道(小肠:十二指肠、空肠、回肠;大肠:盲肠、结肠、直肠)切片观察及小肠质构、小肠(十二指肠、空肠、回肠)粘膜组织(绒毛高度、绒毛宽度、隐窝深度、肌层厚度)、血清细胞因子、LBP、LPS、盲肠SCFA含量的测定,为复配粉在改善胃肠道结构和内环境健康方面的作用提供科学依据。结果表明,高蛋白膳食对老年小鼠肠道结构不利,复配粉干预显著性提高了高蛋白膳食老年小鼠小肠的坚实度、弹性、断裂力和断裂距离,改善高蛋白膳食老年小鼠胃肠道组织形态和结构,且对高牛肉蛋白组的改善效果更显著。消食片对高蛋白膳食组老年小鼠肠道改善效果不明显。复配粉降低了高蛋白膳食老年小鼠促炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β)含量,提高了抗炎性细胞因子(IL-10)含量。LBP、LPS显著性降低。肠道SCFA含量显著增加,并呈量效关系,且对高鱼肉蛋白膳食组胃肠道改善效果更明显。(3)复配粉对高蛋白膳食老年小鼠肠道酶活性的影响及分子机制借助通路分析和基因、蛋白表达水平,就老年小鼠蛋白质代谢和酶活性在分子层面的比较,研究高蛋白膳食代谢的具体情况和可能的代谢酶、代谢通路情况。通过对高牛肉蛋白组和高鱼肉蛋白组蛋白质代谢通路KEGG预测,发现复配粉的干预能够促进氨基酸代谢途径。进而通过蛋白质代谢相关酶活性测定,发现复配粉能够提高高牛肉蛋白和高鱼肉蛋白膳食老年小鼠胃蛋白酶活性,提高高鱼肉蛋白膳食老年小鼠胰蛋白酶和肠肽酶活性,而竞争性降低高牛肉蛋白膳食组胰蛋白酶和肠肽酶的活性。进一步通过RT-qPCR和Western blot分子生物学技术探究蛋白质代谢关键酶在mRNA和蛋白水平表达量,发现复配粉干预上调了高蛋白膳食老年小鼠APN、PepT1、GDH关键酶在转录和翻译水平的活性。(4)复配粉对高蛋白膳食老年小鼠肠道菌群的影响对各试验组老年小鼠盲肠内容物肠道菌群16S rRNA的V3-V4区域高通量测序,分别进行了Alpha多样性分析、Beta多样性分析、群落结构分析、肠道菌群和代谢组学联合相关性分析。结果发现,高蛋白膳食降低了老年小鼠厚壁菌门(Firmicutes)水平,增加了拟杆菌门(Bacteroidetes)水平;而复配粉的干预增加了厚壁菌门(Firmicutes)水平,降低了拟杆菌门(Bacteroidetes)水平,且F/B增大,呈量效关系。进一步对相对丰度前20属水平物种分析发现,复配粉干预后,乳杆菌属(Lactobacillus)显著增多。最后通过肠道菌群和代谢产物中25种氨基酸相关性分析进一步证明了上述结论,即复配粉通过调节高蛋白膳食老年小鼠肠道菌群的种类和数量,增加乳杆菌属(Lactobacillus)和某些非优势菌但与氨基酸代谢相关、且对人体健康有利的菌群的丰度,如产粪甾醇真菌属(Eubacterium coprostanoligenes)、布劳特氏菌(Blautia)等,进而竞争性降低有害菌群的丰度,保护肠道屏障,促进肠道健康,提高了蛋白质的消化性。