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球虫病是危害养禽业的一类严重的寄生虫病,在抗球虫免疫反应中,细胞免疫反应所起的作用要大于体液免疫的作用,为了研究核酸疫苗和重组蛋白疫苗对鸡球虫病的防治效果,进行了以下试验:1.球虫子孢子表面抗原基因(3-1E、CDPK)的克隆:分别以E.tenella GS和E.acervulina QH株孢子化卵囊总RNA为模板,按照GenBank发表的序列合成引物,进行RT-PCR,扩增产物与pGEM-T Easy载体连接后,转化入JM109感受态细胞,将PCR和酶切鉴定正确的阳性菌落进行测序.结果表明,扩增的两个虫株的3-1E基因的ORF大小均为513bp,共编码171个氨基酸,Et GS 3-1E与文献报道的Ea 3-1E同源性为99.6﹪,Ea QH 3-1E与文献报道的Ea 3-1E同源性为99.2﹪,Et GS 3-1E与Ea QH 3-1E同源性为99.6﹪;Et GS CDPK的ORF为1470个碱基,共编码490个氨基酸,与文献报道的Et CDPK同源性为99.6﹪.2.基因的表达与纯化:按照pGEX-6P1表达载体的多克隆位点,重新设计添加相应酶切位点的引物,进行Et.GS株3-1E和CKPK基因的亚克隆,将亚克隆的基因与表达载体进行酶切后连接,将鉴定正确的阳性菌落转化其宿主菌BL21进行诱导表达,并将表达产物通过GST纯化柱进行了纯化.通过SDS-PAGE表明,在加入IPTG诱导剂5h左右即可达到较高水平的表达,其中pGEX-3-1E表达产物占菌体总蛋白的43.3﹪,pGEX-CDPK表达产物占菌体总蛋白的35.4﹪.表达的融合蛋白均为可溶性蛋白,将超声裂解后的上清直接过柱纯化,得到了高纯度的重组蛋白.3.真核表达质粒的构建及体外表达检测:将所克隆的3-1E、CDPK基因以及IFN-γ单独或串连于真核表达质粒pcDNA3.1/Zeo(+),成功构建了单价、双价和三价的真核重组质粒;pcI、pcC、pcE、pcCE、pcEI、pcCEI等7种.通过脂质体转染试剂盒将pcE和pcC真核重组质粒转染入BHK细胞,收集对数生长期的细胞,提取细胞的总RNA,反转录之后使用特异性引物进行PCR扩增,检测质粒在细胞中的转录情况,琼脂糖电泳检测到各自的特异性条带,说明pcE和pcC真核重组质粒可在真核细胞中诱导表达蛋白.4.真核表达质粒和重组蛋白的免疫原性研究及体内表达检测:采用MTT法对构建的真核表达质粒和重组蛋白进行了淋巴细胞转化试验,研究表明,在一免后7天,各免疫组淋转水平均有不同程度的提高,在二免后7天和感染后7天,各免疫组淋转水平有显著性提高,说明随着免疫时间的延长及加强免疫后,各免疫组具有较强的诱导鸡的细胞免疫反应的能力.通过对pcE和pcC免疫组肌肉组织基因组DNA的提取、总RNA的提取,反转录、PCR鉴定结果表明,核酸疫苗至少可在体内存在并持续表达1个月.5.真核表达质粒和重组蛋白对球虫感染鸡的保护研究:在每次核酸疫苗免疫鸡只前对注射部位进行25﹪蔗糖的预处理,间隔一周两次免疫,二兔后7天攻击3×10<'4>个Et GS卵囊,7天后杀鸡观察免疫组的保护效果.结果表明,免疫组与感染对照组相比,均可降低卵囊产量(50~80.71﹪)、降低病变值(20~57.5﹪)、提高相对增重率(83.41~103.06﹪),综合抗球虫指数(ACI)达到或接近中等(150.12~171.09)的抗球虫效果.