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研究背景及目的:慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）简称慢乙肝,为严重影响人类健康的一大卫生问题。据不完全数据统计,目前全球约有乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）慢性感染者2.57亿人。慢性HBV感染显著增加了患肝硬化、肝细胞肝癌和肝衰竭的风险。临床上,根据有无症状和肝功能损害情况将慢性HBV感染者分为无症状乙肝病毒携带者（As C）和慢性乙型肝炎患者。目前临床上判断肝脏炎症活动性的参考指标主要包括血清肝功能指标水平和肝脏穿刺活检结果。及时把握抗病毒治疗时机是控制慢乙肝发展为肝硬化、肝癌等重大肝病的关键。外泌体是直径在40~160nm之间的细胞外囊泡。真核细胞内的多囊泡体（MVB）通过与细胞膜融合,将其内部的外泌体释放到细胞外环境中。外泌体通过与受体细胞的细胞膜发生融合,将其内部的核酸、蛋白质、脂质等物质传递至受体细胞,从而发挥多种生物学功能。Micro RNA（miRNA）作为一种进化高度保守的内源性非编码小RNA,其通过与m RNA的3’-UTR区结合,参与转录后基因表达的调控。既往研究发现,慢乙肝患者血浆、尿液中表达的miRNA与健康人群相比存在显著差异,这提示miRNA可能参与到慢乙肝的发生发展过程。据报道,血浆中的miRNA主要在外泌体中分布,且外泌体miRNA受其表面膜的保护而不易被核酸酶降解,具有更好的稳定性,由此启发我们通过对慢乙肝患者血浆外泌体miRNA的表达特征进行分析,探讨其在慢乙肝炎症活动中的作用及临床意义。同时,既往研究发现,乙肝患者血浆外泌体内含有HBV病毒蛋白及核酸成分,但尚无研究检测乙肝感染者血浆外泌体内HBV DNA水平,我们通过对外泌体内HBV DNA水平的定量分析,并探究HBV利用外泌体在细胞间传播的可能性。总之,本研究通过对乙肝感染者血浆外泌体miRNA的表达特征及HBV核酸含量的分析,探索并讨论了HBV造成慢性感染可能的发病机制。研究方法:纳入2019年5月至2021年5月期间的64名确诊慢性HBV感染且尚未曾经过抗病毒治疗的患者和44例健康对照者（HC）。其中根据慢性HBV感染者有无症状及血清肝功能指标水平是否高于正常参考上限,将慢性HBV感染者分为无症状HBV携带者组（As C）（包括慢性HBV携带状态和非活动性HBs Ag携带状态）,和慢性乙型肝炎组（CHB）（包括HBe Ag阳性/阴性CHB）。本研究经过浙江大学医学院附属第一医院伦理委员会批准【批准号:（2015）科研快审第（497）号)】,实验严格按照赫尔辛基宣言原则进行。首先,采用透射电镜检测、纳米颗粒追踪分析仪分析和外泌体标志蛋白的检测进行血浆外泌体的鉴定。我们通过对4例HC和4例CHB患者的血浆外泌体小RNA进行高通量测序分析,筛选出差异表达的外泌体miRNAs。进一步,联合miRanda数据库、RNAhybrid数据库和Targetscan数据库预测差异表达的miRNAs靶基因并进行KEGG富集分析和GO富集分析,探讨差异性miRNAs可能的生物学功能。进一步,我们根据测序结果筛选出Log2Fold Change＞1.5或＜-1.5且具有显著差异（P-Adjust＜0.001）的miRNAs,并结合既往文献报道的差异miRNAs在乙肝病毒复制、感染和肝癌中可能发挥的生物学功能,我们选择了4个候选miRNAs（miR-21-3p、miR-142-5p、miR-374b-3p及miR-493-5p）。采用q RT-PCR技术验证候选外泌体miRNAs在验证样本（HC组40例、As C组33例、CHB组27例）中的表达水平。采用Spearman相关分析评估候选外泌体miRNAs与患者血清ALT、AST及HBV DNA水平之间的相关性。通过ROC曲线分析评估候选外泌体miRNAs对CHB的诊断价值。进一步对候选外泌体miRNAs靶基因预测及KEGG富集分析,GO富集分析和构建基因-通路网络图探索候选miRNAs可能的生物学功能。另外,我们筛选出CD63阳性的外泌体（CD63+外泌体）,并提取其总蛋白和DNA,分别检测CD63+外泌体内的HBs Ag蛋白及HBV DNA的水平。通过细胞-外泌体摄取实验,观察外泌体能否被Hep G2细胞摄取,从而探究HBV利用外泌体作为载体在细胞间传播的可能性。研究结果:外泌体miRNA的高通量测序结果分析发现:与HC组比较,CHB组共有90个差异表达的miRNAs,其中包括60个上调miRNAs和30个下调的miRNAs。进一步的KEGG富集分析发现,60个上调的miRNAs预测靶基因在c GMP-PKG信号通路和c AMP信号通路上富集,而30个下调的miRNAs预测靶基因在MAPK信号通路上富集。通路-基因网络图提示涉及c AMP通路的miRNAs靶基因除了与c GMP通路之间存在交互作用,与人巨细胞病毒（HCMV）感染、肿瘤相关信号通路和内分泌信号通路之间也存在交互作用。而涉及MAPK信号通路的miRNAs靶基因同时与感染、破骨细胞分化、肿瘤相关通路之间有交互作用。q RT-PCR结果提示与HC组和As C组相比,miR-142-5p和miR-493-5p在CHB组中表达增加。与HC组相比,miR-21-3p和miR-374b-3p在As C组及CHB组中表达均增高。此外,miR-142-5p、miR-374b-3p和miR-493-5p表达与血清ALT、AST水平呈正相关。MiR-493-5p与血清HBV DNA水平呈正相关。ROC曲线分析提示,与HC组相比,CHB组患者中miR-142-5p和miR-142-5p+miR-493-5p联合的AUC值均为0.911,诊断敏感度分别为91.1%和77.8%、特异度分别为77.5%和87.5%。生物信息学分析提示miR-21-3p可能通过调节DDX58和IFIH1的表达而抑制机体对HBV的免疫应答过程,进而介导HBV的清除与复制;而miR-493-5p可能通过沉默RRN3的表达抑制核糖体生成过程从而促进HBV的复制。进一步构建的DDX58和IFIH1的通路-基因网络图显示,DDX58和IFIH1共同参与RIG-I样受体信号通路和多种病毒感染相关通路（乙肝病毒、流感病毒A、单纯疱疹病毒1、麻疹病毒）。除此之外,DDX58还参与到NF-κB信号通路、胞质DNA识别通路、丙肝病毒和EB病毒感染相关信号通路上。最后,我们发现乙肝感染者的血浆外泌体内存在HBs Ag蛋白且含有高水平的HBV DNA,平均占血浆HBV DNA水平的72.5%（95%CI:67.9%~77.1%）。细胞-外泌体摄取实验结果提示血浆外泌体可被Hep G2细胞摄取。研究结论:1、血浆外泌体miR-142-5p或miR-142-5p+miR-493-5p联合有可能作为辅助诊断CHB炎症活动的新型标志物。2、HBV可能利用外泌体作为载体在细胞间传播。