【摘 要】
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背景:角膜创伤反应可导致角膜基质纤维化而使角膜失去透明性,肌成纤维细胞的生成及持续存在是角膜基质纤维化的重要因素。上皮基底膜（epithelial basement membrane,EBM）主要通过限制转化生长因子β（transforming growth factor,TGF-β）和血小板衍生生长因子（Platelet derived growth factor,PDGF）等角膜基质纤维化相关
【基金项目】
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项目名称:TGF-β3对角膜基质体外三维培养模型中纤维化细胞外基质合成的影响,项目合同编号:81360144,项目来源:国家自然科学基金项目,项目起止时间:2014.01-2017.12; 项目名称:角膜基质三维培养模型细胞外基质构筑的研究,项目合同编号:2017GXNSFAA198250,项目来源:广西自然科学基金项目,项目起止时间:2017.09-2020.09; 项目名称:广西医学高层次骨干
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背景:角膜创伤反应可导致角膜基质纤维化而使角膜失去透明性,肌成纤维细胞的生成及持续存在是角膜基质纤维化的重要因素。上皮基底膜（epithelial basement membrane,EBM）主要通过限制转化生长因子β（transforming growth factor,TGF-β）和血小板衍生生长因子（Platelet derived growth factor,PDGF）等角膜基质纤维化相关因子进入基质,而调节角膜基质纤维化。有缺陷的EBM再生通过限制角膜基质制纤维化相关因子渗入角膜基质层对肌成纤维细胞生成及生物学行为发挥调控作用。角膜损伤后EBM结构的重建及其功能恢复对角膜组织的转归至关重要。目前我国角膜穿通伤引起的角膜混浊仍是导致视觉功能障碍的主要原因之一,而角膜穿通伤后早期角膜EBM的再生过程相关研究及其干预靶点的研究较少。本研究采用兔角膜环钻穿通伤模型探讨角膜穿通伤早期修复过程中角膜的组织学、病理生理变化、EBM的再生、以及EBM蛋白组分和角膜基质纤维化相关因子mRNA的表达情况,为角膜穿通伤的抗瘢痕治疗方法研究提供新的思路。目的:观察角膜穿通伤模型中角膜上皮、EBM和基质的修复过程,和角膜损伤后EBM组分和纤维化相关因子的表达情况,以探索EBM再生与角膜基质纤维化的关系。方法:采用随机数字表法将42只新西兰白兔分为建模后1、3、5、7、14、21和30 d组,每组6只,均取右眼建模作为实验眼。另取6只未经任何处理的新西兰白兔作为正常对照组。应用2.0 mm环钻建立兔角膜环钻穿通伤模型。建模后各组于相应时间点在裂隙灯显微镜下观察角膜,Image J软件测定角膜荧光素着色面积评估上皮愈合情况,Fantes分级量表评估角膜混浊程度,苏木精-伊红染色观察角膜上皮和基质修复情况,透射电子显微镜下观察EBM再生情况,用以评估兔角膜穿通伤早期EBM的修复和再生过程。在以上时间地点取样,采用Real-time PCR检测兔角膜伤口区中EBM组分:巢蛋白1（nidogen1,NID1）、层粘连蛋白3（laminin3,LAMA3）、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖2（heparan sulfate proteoglycan2,HSPG2）和Ⅳ型胶原蛋白（CollagenⅣ,ColⅣ）等基因mRNA表达情况,纤维化相关因子:TGF-β1、TGF-β3和PDGF-AA和纤维化标志物α-SMA基因mRNA的相对表达情况。结果:兔角膜穿通伤后各组角膜荧光素染色面积总体比较,差异有统计学意义（F=3 398.88,P<0.01）,其中建模后1、3、5、7和14 d各组角膜上皮荧光素着色面积分别为（4.00±0.10）、（3.11±0.10）、（2.00±0.06）、（0.90±0.04）和（0.67±0.03）mm~2,角膜上皮荧光素着色面积逐渐缩小,两两比较差异均有统计学意义（均P<0.05）;建模后21 d和30 d均未见角膜上皮荧光素着色。建模后1、3、5、7、14、21和30 d角膜混浊程度评分分别为3.44±0.53、0.67±0.25、1.33±0.50、2.11±0.60、2.44±0.53、3.22±0.44和3.78±0.44,建模后1～5 d角膜混浊评分下降,建模后5～30 d角膜混浊评分逐渐升高,不同时间点实验眼角膜混浊评分总体比较,差异有统计学意义（F=51.182,P<0.01）。苏木精-伊红染色结果显示角膜伤口区开始由纤维斑块填充,建模后3 d单层上皮覆盖,建模后5 d大量成纤维细胞及其分泌的细胞外基质填充,建模后21 d及30 d前部基质中胶原纤维排列紧密。透射电子显微镜下观察结果显示,伤口区由肌成纤维细胞及不规则胶原纤维填充,建模后21 d角膜基质开始重塑,EBM于建模后21 d和30 d开始不完全再生。Real-time PCR检测结果显示建模后EBM组分:NID1、LAMA 3、HSPG2和ColⅣmRNA相对表达量较空白对照均升高（P<0.05）。且各组分mRNA相对表达量随时间的变化呈波动性。NID1、LAMA 3和HSPG2 mRNA相对表达量在建模后3d、14d和30d高表达,ColⅣmRNA相对表达量在建模后3d、7d和30d高表达;建模后角膜基质纤维化相关因子:TGF-β1、TGF-β3、PDGF-AA和α-SMA mRNA相对表达量均有不同程度的升高。建模后各时间点TGF-β1和TGF-β3 mRNA相对表达量较空白对照均升高（P<0.05）。建模后7d PDGF-AA mRNA相对表达量较空白对照均升高（P<0.05）。建模后5dα-SMA mRNA相对表达量较空白对照均升高（P<0.05）。TGF-β1和α-SMA mRNA相对表达量于建模后7d高表达,TGF-β3和PDGF-AA mRNA相对表达量于建模后14d高表达。结论:兔角膜穿通伤后角膜纤维化启动并逐渐加重,EBM不完全再生。兔角膜穿通伤后EBM不完全再生可能减轻角膜纤维化相关因子的分泌和肌成纤维细胞的分化。
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