bFGF对川金丝猴耳缘成纤维细胞的影响

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川金丝猴作为我国濒危野生动物,被列为中国濒危动物红皮书与濒危野生动植物国际贸易公约,为了更好地保护川金丝猴这一中国特有物种,各地纷纷建立自然保护区以求尽可能保护川金丝猴栖息地,减少人为影响,除建设自然保护区等宏观保护手段外,寻求其他方法能够保护川金丝猴种群数量与生态多样性,引起了国内外科研工作者的兴趣。近年来,对于川金丝猴种质资源的保护都倾向于宏观方面,涉及细胞水平等方面的微观研究却较少,而细胞资源恰恰是保护濒危动物的重要遗传资源。本研究着手于微观研究,探索碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对于川金丝猴耳缘成纤维细胞体外培养、生长分化、基因表达、线粒体膜电位、转录组分析等方面的影响。(1)川金丝猴成纤维细胞体外分离、体外培养。从死亡的成年雄性川金丝猴身上获取耳缘皮肤组织,采用组织块培养法,获得大量原代细胞,对川金丝猴耳缘成纤维细胞继续培养7d,培养初期,成纤维细胞维持典型的长梭状,胞质饱满且能看到卵圆形的细胞核,但培养至P10代时,成纤维细胞呈现出退化趋势,成纤维细胞只能勉强维持梭状,有些细胞甚至已经不能保持梭状,胞质不再饱满,细胞核不明显,随即对成纤维细胞同时进行CCK8试剂盒检测,结果发现,随着传代次数的增加,细胞活力反而呈现出下降趋势,在培养的5d、6d、7d,P1代细胞活力高于P4、P10代细胞且具有统计学差异(p<0.05),P4、P10代之间细胞活力并没有显著差异(p>0.05);(2)bFGF处理川金丝猴耳缘成纤维细胞。本研究使用bFGF处理川金丝猴耳缘成纤维细胞,处理过后,川金丝猴成纤维细胞继续维持长梭状,CCK8试剂盒检测细胞活力,经过bFGF处理的实验组川金丝猴成纤维细胞细胞活力在培养3d、4d、5d显著高于未使用bFGF处理的对照组成纤维细胞活力(p<0.05)。整合素β1(ITGβ1)无论是m RNA水平还是蛋白质光密度值,实验组显著升高(p<0.05),且有统计学意义。免疫荧光染色法定位ITGβ1发现实验组荧光强度高于对照组,表明经过bFGF处理后,细胞保持活力;(3)转录组数据测序中,实验组与对照组基因质量检测保持一致,数据可用于下一步分析,相对于对照组,实验组上调基因1668个,下调基因1414个且相关信号通路富集在P13K与MAPK信号通路上,并且协同激活了WNT信号途径,从而使成纤维细胞保持活力,进行增殖;(4)bFGF处理后,细胞培养至P3和P8代,细胞活力存在差异,但是差异性不显著,并且在细胞培养后期,成纤维细胞成功表达了成纤维细胞标志物PRRX1、TWIST2、ESRRB、vimentin、FSP1和FBN1。P8代细胞ESRRB、FBN1、PRRX1表达水平显著高于P3(p<0.05)。TWIST2、Vimentin、FSP1表达水平有差异,但差异无统计学意义(p>0.05),P3代成纤维细胞PNPT1、TIM23、Cyto C的表达水平明显低于P8且具有显著性差异(p<0.05),P3和P8代细胞线粒体膜电位无显著性差异,表明经bFGF处理过后的成纤维细胞保持活力且有向造血细胞系分化的趋势。本研究通过原代成纤维细胞体外培养和bFGF小分子处理,bFGF处理过后的川金丝猴耳缘成纤维不仅能在形态学上保持其经典的长梭状,维持细胞形态,还可以增加细胞活力。实验组基因水平表达还出现了造血细胞与间充质细胞表达基因,为成纤维细胞诱导分化成多能干细胞的潜力提供参考。
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