生化药品是指从动物的器官、组织、体液、分泌物中经前处理、提取、分离、纯化等制得的安全、有效、质量可控的药品。这类药品的原材料来源自生物体,因此,相比于化学合成药品,前者的成分更为复杂,在药品质量控制方面也存在很多难点,其中,明确制药所用原材料的动物来源是生化药品质量控制的第一步。因为不同动物来源的药品其药效可能存在一定差异,并且不同来源的动物制品滥用可能会导致人畜共患疾病的传播以及宗教冲突的发生。中国药典严格规定,来源于动物组织提取的药品,必须明确所用动物种属。但是目前,现行标准中并没有针对生化药品中动物源性成分的具体鉴别方法。传统的形态学鉴别方法简单、便捷,但对于外观形态没有明显差异的样品,或者因加工导致丧失形态学特征的样品并不能进行准确的区分。为此,本课题尝试建立聚合酶链式反应法(Polymerase Chain Reaction,PCR)和质谱法对生化制药不同环节的中间体和成品制剂中的动物源性成分进行分析和鉴定。基于DNA水平的种属鉴别方法研究:DNA作为生物体最主要的遗传物质,储存着大量的遗传信息。本文首先基于DNA水平,以PCR方法为基础,建立了多种分子生物学方法来鉴定生化药品中的动物源性成分。首先,本文建立了常规PCR方法对混合动物骨粉和骨肽类制剂热压提取中间体中含有的动物源性成分进行了鉴定,确定9家企业提供的共19批热压提取中间体样品均只含有猪源性成分,未检出牛、羊源成分。随后,本文又建立了可对PCR扩增结果进行确证的限制性片段长度多态性方法(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)和操作更加简便的实时荧光定量PCR方法(Real-time Fluorescence Quantitative PCR,q-PCR)分别对垂体前叶、垂体后叶、玻璃酸酶、糜蛋白酶原四种生化药品粗品和小牛血清、小牛脾匀浆两种动物脏器原材料进行了鉴定。结果表明,两种方法均可用于这六种样品的动物源性成分,其中,在羊源玻璃酸酶样品中检测到了牛源性成分,证实了对生化药品原材料中动物源性成分进行鉴定的必要性。本文还建立了可在一次PCR扩增中同时鉴定猪、牛、羊三种动物源性成分的多重PCR方法和技术准确度较高的DNA条形码分子鉴定法,并成功运用于具体样品的种属鉴定。基于DNA水平建立的五种方法均具有良好的特异性和灵敏度且各有优点,同一份样品采用不同的方法进行鉴定所得到的结果一致,这些方法可被用于生化药品动物源性成分的鉴定。基于特征肽段分析的质谱鉴定方法:某些样品如动物血清,其本身核酸含量过低,采用分子生物学方法进行种属鉴定存在局限性。根据不同动物来源的同一种蛋白质其氨基酸组成存在差异这一理论基础,本文尝试建立了基于特征肽段分析的动物血清质谱鉴定方法。首先通过比对家猪(Sus scrofa)、黄牛(Bos taurus)、绵羊(Ovis aries)、山羊(Capra hircus)、马(Equus caballus)五种常见家畜的血清白蛋白氨基酸序列,找出种属特异性特征肽段,然后将血清样品经过还原烷基化和胰酶酶解处理后,利用UPLC-Q-TOF-MS分离肽段混合物并进行检索和鉴定,成功鉴别出三份血清样品的种属来源。本文还尝试采用类似的前处理方法,对因高度加工导致核酸被严重破坏的骨肽注射液中的胶原蛋白肽的种属来源进行鉴定,质谱分析结果表明,该方法确实在骨肽注射液中鉴定到了部分猪源胶原蛋白肽。综上,本文基于DNA水平建立了多种鉴定生化药品动物源性成分的分子生物学方法,并对利用质谱法鉴定蛋白特征肽段区分种属做了探索性的研究。另外,本文所研究的样品涉及到原材料、粗品、中间体和制剂,扩大了方法的适用范围。上述方法的建立对更好地保障生化药品的安全性具有积极作用,可为生化药品生产企业和药品监督检验机构提供一定的参考价值。