目的:通过构建前列腺癌失巢凋亡耐受细胞模型探究失巢对细胞凋亡、侵袭、迁移和自噬的影响。方法:采用持续悬浮培养前列腺癌PC-3、DU145细胞一周后重新贴壁培养两天的方法构建失巢凋亡耐受细胞模型。通过CCK-8法检测超低黏附培养板（ULAP）中培养的亲本（P）和失巢凋亡耐受（A-R）细胞的存活、增殖能力。应用流式细胞法测定细胞的凋亡水平。采用Transwell小室法检测细胞的侵袭、迁移能力。进一步在亲本和失巢凋亡耐受的PC-3、DU145细胞中分别转染mCherry-GFP-LC3B双标质粒,然后用免疫荧光法检测细胞的自噬流水平,并用透射电镜拍摄细胞中自噬小体。此外,通过蛋白质免疫印迹法检测亲本和失巢凋亡耐受细胞及悬浮时间点前列腺癌细胞中Beclin1、p-Beclin1和LC3B Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平。另外,分别在前列腺癌亲本和失巢凋亡耐受细胞中外源性加入适量自噬激活剂（雷帕霉素）和自噬抑制剂（3-MA）24小时后,应用流式细胞法和蛋白质免疫印迹法检测前列腺癌细胞的凋亡水平和自噬相关蛋白（Beclin1、p-Beclin1 和 LC3B Ⅱ/Ⅰ）表达水平。结果:通过CCK-8法证实,悬浮培养的失巢凋亡耐受前列腺癌细胞的存活和增殖能力显著高于对应的亲本细胞。流式细胞法检测凋亡水平表明,在悬浮培养过程中,失巢凋亡耐受细胞的凋亡率显著低于亲本细胞。Transwell小室实验结果显示,与亲本细胞相比,失巢凋亡耐受PC-3和DU145细胞的侵袭、迁移能力明显增强。免疫荧光法检测细胞自噬流结果发现,失巢凋亡耐受PC-3和DU145细胞的自噬流水平明显高于对应亲本细胞。透射电镜观察自噬小体发现,失巢凋亡耐受细胞中自噬小体数量明显增加。蛋白质免疫印迹结果表明,失巢凋亡耐受前列腺癌细胞中Beclin1、p-Beclin1和LC3B Ⅱ/Ⅰ表达水平明显高于对应的亲本细胞。流式细胞检测结果显示,外源性加入自噬激活剂雷帕霉素可进一步降低失巢凋亡耐受细胞的凋亡率,而加入自噬抑制剂3-MA可明显增加细胞凋亡率。蛋白质免疫印迹结果表明,加入自噬调节剂可显著调控自噬相关蛋白（p-Beclin1和LC3B Ⅱ/Ⅰ）的表达水平。结论:失巢凋亡耐受细胞模型可在前列腺癌PC-3和DU145细胞中成功构建;失巢凋亡耐受前列腺癌细胞的CEMIP表达水平、凋亡耐受能力、侵袭迁移能力和自噬水平均显著增强。目的:研究前列腺癌细胞失巢时内质网应激对CEMIP表达、自噬水平及肿瘤转移的影响。方法:在失巢凋亡耐受前列腺癌PC-3、DU145细胞中,用shRNA沉默CEMIP并外源性加入自噬激活剂（雷帕霉素）或自噬抑制剂（3-MA）,采用流式细胞学检测细胞凋亡率。应用Transwell小室实验和划痕实验检测沉默CEMIP后细胞的侵袭、迁移能力。然后通过免疫荧光法和透射电镜法检测自噬流水平和自噬小体;进一步通过构建稳定过表达和沉默CEMIP的cy3标记的PC-3细胞进行裸鼠尾静脉注射动物实验以验证CEMIP在肿瘤转移中的调控作用。此外,用qRT-PCR法检测亲本和失巢凋亡耐受前列腺癌细胞中CEMIP、内质网应激相关分子以及自噬相关分子的mRNA表达水平。用Western blotting实验来检测不同悬浮时间点的前列腺癌PC-3、DU145细胞以及亲本和失巢凋亡耐受前列腺癌细胞中内质网应激相关分子及自噬相关分子的蛋白质表达水平。通过免疫荧光法和酶标法检测亲本及失巢凋亡耐受前列腺癌细胞内钙离子水平。此外,通过构建并转染过表达转录激活因子4（ATF4）质粒,用qRT-PCR验证转染效率及对CEMIP转录的调控作用;用Western blotting实验检测蛋白表达效率和对CEMIP翻译的调控作用。进一步以功能回复实验（稳定过表达ATF4同时沉默CEMIP）检测ATF4、CEMIP及自噬相关分子（p-Beclin1、LC3B Ⅱ/Ⅰ）的表达水平的变化;ChIP实验验证CEMIP与ATF4的结合情况,进一步通过双荧光报告基因实验证实ATF4与CEMIP的具体结合位点。实验结果:流式细胞检测凋亡率结果显示,沉默CEMIP可显著增加失巢凋亡耐受PCa细胞的凋亡率,且加入自噬抑制剂3-MA后凋亡率进一步升高,而加入自噬激活剂雷帕霉素后细胞凋亡率明显降低。Transwell实验和划痕实验共同证实,沉默CEMIP可显著抑制失巢凋亡耐受PCa细胞的侵袭、迁移能力。免疫荧光实验和透射电镜检测自噬水平表明,沉默CEMIP可显著抑制细胞的自噬流水平和自噬小体数量。进一步通过动物实验证明,沉默CEMIP明显抑制前列腺癌肺转移灶的数量和体积,而过表达CEMIP可逆转该结果。通过qRT-PCR检测证实,失巢凋亡耐受PCa细胞中ATF4和CEMIP mRNA水平明显上调,而自噬相关ATGs无显著差异,Western blotting检测结果显示,不同悬浮时间点ATF4、CEMIP、P-Beclin1及LC3BⅡ/Ⅰ动态变化,且ATF4早于CEMIP在8-16小时达到高峰。功能回复实验证明,过表达ATF4激活自噬的效应会因沉默CEMIP明显抑制。ChIP实验初步证实ATF4可结合CEMIP并促进CEMIP的转录;进一步通过双荧光报告基因实验证实,ATF4和CEMIP的3号结合位点结合调控其转录活性。结论:CEMIP通过激活保护性自噬促进失巢凋亡耐受前列腺癌细胞存活和转移。内质网应激通过上调ATF4来激活CEMIP转录活性。目的:研究CEMIP激活自噬促进前列腺癌细胞失巢凋亡耐受的分子生物学机制。方法:选取前列腺癌PC-3、DU145细胞作为研究对象,并构建过表达、沉默CEMIP质粒。在失巢凋亡耐受前列腺癌细胞（PC-3-AR、DU145-AR）中沉默CEMIP,在亲本前列腺癌细胞（PC-3-P、DU145-P）中过表达CEMIP。在过表达CEMIP的PCa细胞中用蛋白免疫印迹法检测Bcl-2、p-Bcl-2-ser70、Beclin1和p-Beclin1的表达水平。通过构建Bcl-2-GFP和Beclin1-GFP荧光质粒,并根据共转染并结合后方能呈现荧光的原理进行双荧光互补实验检测Bcl-2和Beclin1结合情况,此外通过蛋白免疫共沉淀（Co IP）实验和免疫荧光实验共同验证过表达CEMIP对Bcl-2和Beclin1结合的影响。应用si RNA沉默内源性Bcl-2,并构建Bcl-2-ser70突变质粒。在前列腺癌细胞中过表达CEMIP且沉默内源性Bcl-2的前提下,转染Bcl-2-ser70突变质粒,以蛋白免疫印迹法检测Bcl-2、p-Bcl-2-ser70、Beclin1和p-Beclin1的表达水平变化情况。另外分离蛋白提取试剂盒提取蛋白,通过蛋白免疫印迹法检测PKCα蛋白胞内分布情况。进一步通过免疫荧光法检测过表达CEMIP后PKCα的细胞内定位的变化。构建并转染沉默PKCα质粒,q RT-PCR验证其转染效率。进一步在过表达CEMIP基础上沉默PKCα,通过蛋白免疫印迹法检测Bcl-2,p-Bcl-2-ser70的表达水平变化。同时通过Co IP实验来检测PKCα在Bcl-2和Beclin1结合中的作用。结果:在过表达CEMIP的PCa细胞中用蛋白免疫印迹法检测结果显示,过表达CEMIP明显促进p-Bcl-2-ser70、p-Beclin1表达水平上调,而Bcl-2表达无明显变化。双荧光互补实验可初步证明Bcl-2可与Beclin1结合,且过表达CEMIP明显抑制Bcl-2与Beclin1的结合水平。进一步通过Co IP实验证实,上调CEMIP可促进Bcl-2/Beclin1复合体的解离,同时免疫荧光法亦证明Bcl-2与Beclin1胞内共定位,过表达CEMIP明显抑制Bcl-2和Beclin1共定位。功能回复实验证实,上调CEMIP促进Bcl-2/Beclin1复合体的解离的分子机制是通过促进p-Bcl-2-ser70表达水平上调实现的。通过蛋白免疫印迹法检测发现PKCα在过表达CEMIP后发生明显的PKCα膜转位,并进一步通过免疫荧光证实上调CEMIP促进PKCα蛋白发生膜转位。转染沉默PKCα质粒后用q RT-PCR证实沉默组明显降低了PKCα的m RNA水平。在上调CEMIP的同时敲低PKCα进行的功能回复实验证明,上调CEMIP显著促进p-Bcl-2-ser70的表达升高可因沉默PKCα明显逆转。进一步通过Co IP实验证实上调CEMIP明显增加Bcl-2/Beclin1复合体的解离,而沉默PKCα则明显逆转该实验结果。结论:过表达CEMIP通过增加PKCα膜转位促进磷酸化Bcl-2-ser70以增加Bcl-2/Beclin1复合体的解离来激活自噬。