研究背景与目的恶性肿瘤严重威胁人类健康。结直肠癌是常见的胃肠道恶性肿瘤。在我国，结直肠癌的发病率和死亡率逐年上升，目前居于第4位。在我国大城市中，结直肠癌发病人数以每年4%的增长速度上升。由于人们生活方式、饮食结构的改变，平均寿命的提高，结直肠癌的发病率还有进一步上升的可能。结直肠癌在全世界每年新发病120万例，确诊后，患者的5年存活率仅55%。造成这种现状的原因主要有3个：1、结直肠癌的病因不明确，因此无法做到有效的一级预防；2、缺乏便捷、高效的诊断方法，这种情况使肿瘤的二级预防成为空谈；3、治疗手段虽多，但总体疗效不理想，且治疗过程中的副作用给患者带来的痛苦远大于其益处。因此，对结直肠的研究，无论是病因还是筛查、早期诊断，或是治疗方式方法，都有可能使现患病者和高危人群以及其他潜在患者受益。目前结直肠癌常用的诊断方法有：1、内镜检查，如纤维结肠镜、电子结肠镜；2、血清学检查，多种肿瘤标志物的检测；3、影像学检查，如CT、MRI、胃肠道钡餐造影、TRUS(经直肠超声检查)等；4、其他检查，如基因学检查。以上各种方法均不同程度地存在病人依从性差、特异度和检测灵敏度不高等问题。在治疗方面，除了对已有治疗手段的不断改进，新药的开发，尤其是靶向药物的开发也取得了丰硕的成果。此外，对结直肠癌治疗的认识也发生了转变，个体化治疗为越来越多的人接受并得到前所未有的重视，它的基础是明确的靶点和有效的疗效预测蛋白。随着蛋白质组学，尤其是疾病蛋白质组学的不断发展，大量的疾病差异蛋白被发现，经过后续研究，从中遴选出疾病的诊断、分子治疗及其预后判断的分子生物学标志物。蛋白质组学的进步离不开蛋白质组学技术的迅猛发展。同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）技术功能强大，能同时对多个样品进行相对和绝对定量研究。多维液相色谱分离和串联质谱（LC/MS）联合iTRAQ技术能得到完整的疾病蛋白质组，并能定量其中的蛋白。本研究旨在应用这种蛋白质组学技术，通过对正常结直肠粘膜及结直肠癌肿瘤组织进行分析，鉴定并验证得到对结直肠癌有诊断或治疗意义的分子标志物。方法1、研究对象2、组织标本的收集(1)新鲜组织标本的收集：在手术中，标本离体后30分钟内收集新鲜组织标本，深低温保存；(2)石蜡组织标本的收集：组织标本经福尔马林固定后制成蜡块以备检测。3、iTRAQ联合LC/MS鉴定结直肠癌肿瘤组织与正常结直肠粘膜差异蛋白分别将5例正常粘膜样本蛋白及5例肿瘤组织样本蛋白混合，经胰酶消化以后，用iTRAQ定量试剂盒分别标记上述两种组织蛋白。首先用强阳离子交换对上述蛋白混合物进行第一维分离，根据峰型和时间共收取20个梯度；然后采用反相色谱与质谱联用技术对上述样品进行第二维分离，据此采集多肽质谱图并对蛋白质进行定量；经数据库搜索，描绘出结直肠癌组织差异蛋白质谱。结合生物信息学数据库分析差异蛋白质亚细胞定位和功能并筛选出目的蛋白。4、免疫组化检测目的蛋白在组织中的亚细胞定位以免疫组织化学法检测其表达水平。收集58例结直肠癌肿瘤组织和远端正常粘膜组织，经福尔马林固定后，行石蜡包埋，然后切片。组织切片经脱蜡至水、高压修复抗原、双氧水封闭内源性酶后，顺序孵育一抗、二抗；然后用DAB显色、再经过苏木素复染。采用双盲法由两位病理学医师对实验结果进行判断。诊断标准：在5个视野观察200个上皮细胞，观察染色强度和阳性细胞数后进行打分，两者相加之和即为评分。根据阳性细胞的百分比打分的标准：0分--阴性；1分--阳性细胞数<10%；2分--11%≤阳性细胞数﹤50%；3分--51%≤阳性细胞数﹤80%；4分--阳性细胞数≥80%。根据染色强度进行打分的标准：0分--无；1分--弱阳性；2分--中等阳性；3分--强阳性。5、Western-blotting实验用Western-blotting实验验证目标差异蛋白的表达。取适量样本蛋白行SDS-PAGE，然后转膜，顺序孵育一抗、二抗。然后用电化学发光法显示条带。所得条带用PD QUEST软件进行半定量分析。4、q RT-PCR检测目的基因的表达通过q RT-PCR检测EHD2、PDLIM7的基因在结直肠癌肿瘤组织及正常粘膜组织中的表达。结果1、iTRAQ联合LC/MS鉴定组织差异蛋白质共鉴定到802个蛋白。认定差异蛋白质的标准：1、含量差异P﹤0.05，2、在正常组织与肿瘤组织中的含量比值≥1.5或≤0.5。同时满足以上2项的即为差异蛋白。共有68个差异蛋白（33个上调，35个下调）。经Swiss-Prot和GeneOntcology数据库搜索，差异蛋白定位于细胞核、细胞浆、细胞膜和细胞外基质，其功能与细胞粘附、细胞结构、信号转导、结合等相关。从中挑选了EHD2及PDLIM7进行验证。2、免疫组织化学结果EHD2表达于84.48%的正常粘膜组织，在结直肠癌肿瘤组织中低表达，仅表达25.86%。PDLIM7表达于81.03℅的正常粘膜组织，在结直肠癌肿瘤组织中低表达，仅表达29.31℅。3、Western-blotting和q RT-PCR实验证实了EHD2及PDLIM7在结直肠癌组织中表达低于正常粘膜组织。结论初步描绘了结直肠癌组织差异蛋白质谱，为结直肠癌的病因、发生发展机制、筛查、诊断、预后及治疗的研究提供新的线索。EHD2在结直肠癌肿瘤组织中低表达，很有可能是一个潜在的结直肠癌抑癌基因，有可能为结直肠癌的治疗提供新的靶点。PDLIM7参与了结直肠癌的发生和发展，但其作用及作用机制还有待进一步研究。