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目的1.探讨HNSCC微环境中各种抑制细胞的作用,并且评估其相互作用及关系。2.研究HNSCC免疫抑制网络中主要组成部分Treg、MDSC、PD-1阳性T细胞相互联系、共同抑制机制问题。3.评估HNSCC局部及外周环境中效应性T细胞功能状态,阐述其中的原因及功能恢复机制,探讨免疫治疗的多靶点联合治疗的可行性。方法1.分离外周血PBMC,使用Ficoll密度梯度离心法分离HNSCC组与健康成年组的外周血PBMC,通过多通道荧光流式细胞仪检测PBMC中Treg、MDSC、PD-1阳性T细胞,并进行定量分析,Treg的标志为CD4+CD25+Fox P3+GARP+CTLA-4+Treg,T细胞的标志为CD4+PD-1+/CD8+PD-1+T,MDSC的标志为CD14-HLA-DR-CD11b+CD33+MDSC。2.分离肿瘤TILs,手术切除HNSCC标本用来做癌细胞和TILs分离。使用Ficoll密度梯度离心法分离TILs与肿瘤细胞。同法通过多通道荧光流式细胞仪检测TILs中Treg、MDSC、PD-1阳性T细胞。3.检测外周血PBMC、血清及肿瘤组织中TILs的IL-10、TGF-β1、INF-γ、颗粒酶B的表达,分别使用ELISA、流式细胞术的方法检测。4.筛选免疫耐受型病例即PD-L1和TILs双阳性病例,观察肿瘤组织中PD-L1与TILs的表达情况,应用免疫组化方法检测连续切片中PD-L1、CD3、CD8、Foxp3、CD11b、CD33、CD68抗体染色,检查肿瘤组织及周围基质中Treg、MDSC、PD-1阳性T细胞,总结、分析其表达类型。结果1.HNSCC中的Treg呈现高免疫抑制性表型。HNSCC患者TILs及外周血中的CD4+Foxp3+Tregs比例明显增加,其中CTLA4+Foxp3+Tregs、GARP+Foxp3+Tregs表型均有不同程度的升高,与正常对照外周血比较,差别均有显著性意义。2.HNSCC患者MDSCs比例提高,并且与CD4+Foxp3+Tregs升高呈正相关性。HNSCC患者TILs及外周血中的MDSCs比例明显增加,较正常扁桃体组织、正常对照外周血中的含量均有明显的增多,差别均有显著性意义。%CD4+Foxp3+Treg升高与%MDSC升高之间呈相关性,其中HNSCC-TILs中%CD4+Foxp3+Treg升高与%MDSC升高之间呈强相关。3.HNSCC患者CD4+及CD8+T细胞PD-1表达均增加。HNSCC患者TILs及外周血中的PD-1+CD4+T细胞及PD-1+CD8+T细胞比例均增加,较正常对照外周血中的含量均有明显的增多,差别均有显著性意义。4.HNSCC患者抗肿瘤细胞因子减少,免疫抑制性细胞因子水平提升。HNSCC患者外周血中的IFN-γ含量减少,较正常对照外周血中的含量均有明显的减少,差别有显著性意义。HNSCC患者外周血中的IL-10和TGF-β1水平含量增加,较正常对照外周血中的含量均有明显的增加,差别有显著性意义。CD4+Foxp3+Treg比例升高与高血浆水平TGF-β1之间呈相关性。5.HNSCC体内CD8+CTL细胞杀伤功能活性下降。HNSCC患者TILs的CD8+T细胞中GB明显受到抑制,含量明显减少,比正常对照外周血、HNSCC外周血及正常扁桃体组织中的含量均有明显的减少,差别均有显著性意义,HNSCC外周血PBMC与正常对照外周血PBMC比较没有明显减少,差别没有显著性意义。6.HNSCC肿瘤微环境中肿瘤PD-L1表达与TILs中免疫细胞形成免疫抑制网络。PD-L1在HNSCC肿瘤细胞主要呈膜性表达,23/32例（71.7%）显示PD-L1染色阳性。大部分的标本（22/23）显示染色局限于癌巢和炎性基质之间界面的肿瘤边缘,只有1/23例显示癌巢内的弥漫性PD-L1表达。TILs中同时检测到CD4+T细胞、CD8+T细胞、Fox P3+Treg、MDSC及CD68+TAM细胞,它们构成TILs的主要成分,肿瘤细胞、CD68+TAM与T细胞形成接触性PD-L1:PD-1共抑制机制,Fox P3+Treg、MDSC可能在非PD-L1:PD-1免疫抑制机制中发挥主要作用。结论1.HNSCC中Fox P3+GARP+CTLA4+Treg,MDSC,PD-1+T细胞比例相互增加,IFN-γ减少及相应IL-10和TGF-β1增加,这些因素相互联系、相互作用,是组成HNSCC局部免疫抑制网络的主要部分。2.HNSCC伴随明显的TILs浸润,明显的炎性微环境是头颈鳞癌的重要特点,TILs的炎性免疫反应可能构成肿瘤微环境免疫抑制的主要原因,促进肿瘤的发生、发展。3.大部分肿瘤的肿瘤细胞、CD68+TAM在局部接触T细胞诱导形成PD-1:PD-L1免疫抑制通路,而Treg增加并伴随MDSC相应的增多,也直接抑制CD8+CTL的杀肿瘤效应,形成非PD-1:PD-L1免疫抑制机制。4.GARP可能是消除Treg的一个理想的候选靶点。5.HNSCC肿瘤免疫治疗的重点在局部免疫微环境,联合消除HNSCC肿瘤局部的Treg、MDSC、PD-1+T细胞抑制联系,可以有效解除局部肿瘤微环境的免疫抑制,进一步加强内源性抗肿瘤反应将来有必要采取“科学组合”或“联合治疗”策略。