目的:子宫内膜癌（Endometrial carcinoma,EC）是最常见的妇科恶性肿瘤的一种,在众多恶性肿瘤中发病率较高,同时,在女性的常见癌症中排名第四,其影响仅在乳腺癌、肺癌和结直肠癌之后[1,2]。近年来其发病率和死亡率逐渐升高,有远处转移的子宫内膜癌晚期患者5年生存率小于20%。因此,子宫内膜癌的机制研究显得尤为重要。在众多RNA分子中,Long noncoding RNA（lnc RNA）的核苷酸非编码达到了200个以上,能够与micro RNA（miRNA）相互作用参与m RNA的表达调控,进而在人类癌症的增殖、转移、以及肿瘤的发生过程、诊断过程和预后过程中发挥着重要的作用。最新的研究表明Long intergenic noncoding RNA 958（LINC00958）在人类多种肿瘤组织中显著上调表达[3],下调LINC00958的表达能够抑制鼻咽癌[4]、胰腺癌[5]、肺癌[6]、宫颈癌[7]、胶质瘤[8]等的发生发展。通过生物信息学发现LINC00958在子宫内膜癌患者组织中表达升高[9,10],然而其在子宫内膜癌发生发展中的作用尚未见报道。阴阳因子1（Yin Yang 1,YY1）作为一种转录因子,不仅有着较强的功能性,且是由多种功能综合而成,在人类多种癌组织中过表达,对细胞增殖、细胞活力、上皮间质转化、转移和药物/免疫耐受都具有调节作用[11-13]。上调YY1能促进卵巢癌、乳腺癌、肺癌细胞的增殖和侵袭[14-16]。而且,过表达YY1对于肿瘤的迁移和增殖并不会因体内外的差异而导致作用下滑,其促进作用在任何条件下均适用,抑制YY1则发挥相反的作用[17]。目前,仅生物信息学预测了YY1与LINC00958的启动子区域结合,但是其调控机制未见报道。miRNA是由非编码的单链的小RNA分子组成,且核苷酸的长度可以达到18～22个,即使在转录后也能够将水平调控靶基因充分的表达出来。研究发现miR-378a-3p可作为一种新的肿瘤抑制因子,它的过表达能够抑制卵巢癌的增殖能力,促进卵巢癌细胞的凋亡过程,同时卵巢癌细胞对顺铂的敏感性也可以被miR-378a-3p增强[18]。不仅如此,miR-378a-3p也能抑制肝癌细胞的增殖能力、迁移能力、侵袭能力,肝癌细胞对索拉非尼化疗的敏感性也可以被miR-378a-3p增强[19]。另外,通过生物信息学的分析预测,miR-378a-3p在子宫内膜癌患者的组织中表达下调,而其在子宫内膜癌中的作用未见报道。目前,有文献指出LINC00958能与miR-378a-3p相互作用来调控膀胱癌的增殖和转移[20]。因此,我们推测LINC00958能通过调节miR-378a-3p在子宫内膜癌中发挥重要作用。另外,生物信息学也预测了miR-378a-3p存在YY1的结合位点,但是目前尚无验证证实miR-378a-3p与YY1的靶向关系和作用机制。因此,本研究旨在探讨LINC00958、miR-378a-3p和YY1调控子宫内膜癌恶性生物学行为的机制,证实LINC00958可以通过竞争性抑制miR-378a-3p促进YY1的表达上调,同时YY1又可以作为转录因子,与LINC00958启动子区域结合,靶向调控LINC00958,在子宫内膜癌的发生发展中发挥促肿瘤作用。方法:第一部分:采用q RT-PCR对子宫内膜中的LINC00958进行检测,检测对象包括正常的子宫内膜组织、子宫内膜样腺癌组织、以及5种子宫内膜癌细胞系。分别用过表达LINC00958（Lv-LINC00958）慢病毒和含抗LINC00958短发夹RNA（Lv-sh-LINC00958）的慢病毒转染AN3CA细胞系和HEC-1-A细胞系。采用CCK-8细胞计数法检测子宫内膜癌细胞的增殖能力,采用流式细胞技术检测子宫内膜癌的细胞周期,采用细胞划痕实验检测子宫内膜癌细胞的迁移能力,采用Transwell实验检测子宫内膜癌细胞的侵袭能力,利用Western blot法对cyclin D1、cyclin E、MMP9、MMP2、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2及p-ERK1/2的蛋白表达水平进行检测,通过明胶酶谱实验分析MMP9和MMP2的活性,通过裸鼠体内成瘤实验检测LINC00958对裸鼠肿瘤体积、重量、Ki67的表达、增殖能力、侵袭能力及cyclin D1、MMP2、ERK1/2及p-ERK1/2的蛋白表达水平的影响。第二部分:通过生物信息学分析预测LINC00958、miR-378a-3p及YY1的靶向结合位点。为了更好地了解LINC00958、miR-378a-3p及YY1三者之间的靶向结合关系,需要利用双荧光素酶实验对其进行验证;同时,可以利用q RT-PCR检测到miR-378a-3p及YY1在过表达LINC00958及敲低LINC00958的子宫内膜癌细胞系中的表达水平。通过构建miR-378a-3p mimics及NC mimics,转染HEC-1-A细胞,通过q RT-PCR检测过表达miR-378a-3p对YY1表达的影响情况;通过CCK-8细胞计数法、Transwell实验检测LINC00958/miR-378a-3p/YY1作用轴对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭、迁移能力等恶性生物学行为的调控作用;通过Western blot检测LINC00958/miR-378a-3p/YY1作用轴通过MEK/ERK信号通路调控子宫内膜癌发生发展的机制作用。第三部分:采用双荧光素酶实验及免疫染色质共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,Ch IP）实验进一步探究YY1作为转录因子与LINC00958上游启动子区域结合,调控LINC00958的表达。将Lv-sh YY1+Lv-LINC00958,Lv-sh NC+Lv-LINC00958共同转染AN3CA细胞系,通过q RT-PCR检测Lv-sh YY1+Lv-LINC00958,Lv-sh NC+Lv-LINC00958共同转染后子宫内膜细胞中LINC00958的表达情况。采用CCK-8细胞计数法检测Lv-sh YY1+Lv-LINC00958,Lv-sh NC+Lv-LINC00958共同转染后子宫内膜癌细胞的增殖情况,通过细胞划痕实验和Transwell检测Lv-sh YY1+Lv-LINC00958,Lv-sh NC+Lv-LINC00958共同转染后AN3CA细胞的迁移和侵袭能力,通过western blot实验检测转染后AN3CA细胞中cyclin D1、MMP2、ERK1/2及p-ERK1/2的表达水平。结果:第一部分:与正常的子宫内膜组织相比,子宫内膜样腺癌组织中的LINC00958的表达水平明显上调。在人子宫内膜癌细胞Ishikawa、RL95-2、HEC-1-B、AN3CA和HEC-1-A细胞系中,AN3CA细胞系中的LINC00958的表达水平最低,而HEC-1-A细胞系中的LINC00958的表达水平最高,因此选取AN3CA细胞系及HEC-1-A细胞系进行实验。过表达LINC00958促进子宫内膜癌细胞由G1期向S期过渡,降低了细胞在G1期的积累,增加了S期和G2期的细胞数量,相反敲低LINC00958则使处于G1期的子宫内膜癌细胞增多,处于S期和G2期的细胞减少。同时过表达LINC00958上调子宫内膜癌细胞中cyclin D1和cyclin E的表达,促进细胞周期进程,敲低LINC00958则下调细胞中cyclin D1和cyclin E的表达,抑制细胞周期进程。同时,过表达LINC00958增强了子宫内膜癌细胞的增殖能力、迁移能力及侵袭能力,敲低LINC00958则抑制了子宫内膜癌细胞的增殖能力、迁移能力及侵袭能力。同时,过表达LINC00958促进了子宫内膜癌细胞中的MMP9和MMP2的表达水平及活性,敲低LINC00958则抑制了子宫内膜癌细胞中的MMP9和MMP2的表达水平及活性。在子宫内膜癌细胞中,过表达LINC00958则提高了磷酸化MEK1/2（p-MEK1/2）和磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）的表达水平,而不改变总MEK1/2或总ERK1/2的表达水平。p-MEK1/2与总MEK1/2的比值、p-ERK1/2与总ERK1/2的比值增加,这一结果表明,MEK/ERK途径被LINC00958激活。反之,敲低LINC00958则抑制了这一通路的激活。通过裸鼠成瘤实验发现过表达LINC00958促进体内子宫内膜癌肿瘤的生长过程,促进裸鼠体内子宫内膜癌细胞的增殖能力及迁移能力,提高cyclin D1、MMP2、p-ERK1/2的蛋白表达水平,敲低LINC00958则起到相反的作用。第二部分:生物信息学分析结果显示,miR-378a-3p与LINC00958存在靶向结合关系,这种靶向结合关系在miR-378a-3p和YY1之间也有存在,而双荧光素酶报告基因实验则被用来检测LINC00958与miR-378a-3p、miR-378a-3p与YY1之间的靶向结合关系。将含有miR-378a-3p结合位点的LINC00958野生型载体（wt-LINC00958）及突变型载体（mut-LINC00958）,分别与miR-378a-3p模拟物（miR-378a-3p mimics）或NC模拟物（NC mimics）共转染到HEK-293T细胞中,结果表明miR-378a-3p可以与LINC00958结合。同样,miR-378a-3p也被证实能与YY1的3’UTR结合。过表达LINC00958降低了子宫内膜癌细胞中miR-378a-3p的表达水平,提高了YY1的表达水平,而敲低LINC00958则相反。在LINC00958表达水平较高的HEC-1-A细胞系中转染miR-378a-3p mimics及NC mimics,提示过表达miR-378a-3p时,细胞中YY1m RNA水平显著降低。当miR-378a-3p出现过表达的情况时,子宫内膜癌细胞的增殖及侵袭能力会得到明显的抑制。同理,过表达miR-378a-3p抑制cyclin D1、MMP2、p-ERK1/2的表达,提示miR-378a-3p抑制子宫内膜癌细胞的增殖、侵袭能力,并和MEK/ERK信号通路有关。第三部分:双荧光素酶报告基因实验证实了YY1与三个不同长度的LINC00958启动子区域之间的结合关系,提示YY1作为转录因子,可以直接与LINC00958启动子结合。在Ch IP检测后的PCR中,截断的LINC00958启动子的PCR产物表明YY1直接与LINC00958启动子结合。用Lv-sh YY1+Lv-LINC00958或Lv-sh NC+Lv-LINC00958共同感染AN3CA细胞后,CCK-8细胞计数法证实敲低YY1能够逆转过表达LINC00958对子宫内膜癌细胞增殖能力的促进作用,细胞划痕实验证实敲低YY1能够逆转LINC00958过表达对子宫内膜癌迁移能力的促进作用,Transwell实验证实敲低YY1能够逆转LINC00958过表达对子宫内膜癌侵袭能力的促进作用。此外,与转染Lv-sh NC+Lv-LINC00958组相比,转染Lv-sh YY1+Lv-LINC00958的AN3CA细胞系中,cyclin D1、MMP2的表达水平下调,也同样说明敲低YY1可以逆转LINC00958过表达对细胞周期进展、迁移及侵袭能力的促进作用。与转染Lv-sh NC+Lv-LINC00958组相比,转染Lv-sh YY1+Lv-LINC00958组中磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）的表达被抑制,而不改变ERK1/2的总蛋白水平,p-ERK1/2与总ERK1/2的比值降低,提示敲低YY1逆转了过表达LINC00958对子宫内膜癌MEK/ERK信号通路的激活作用。结论:（1）与正常的子宫内膜组织相比,子宫内膜样腺癌组织中的LINC00958的表达水平明显上调。LINC00958能够促进细胞周期内G1期向S期的过渡,促进子宫内膜癌细胞的周期进展。LINC00958明显促进子宫内膜癌增殖、迁移及侵袭能力,与MEK/ERK信号通路的激活有关。LINC00958在裸鼠体内促进子宫内膜癌肿瘤生长,促进子宫内膜癌肿瘤增殖及迁移能力,并通过激活MEK/ERK信号通路发挥作用。（2）在子宫内膜癌中,LINC00958通过ce RNA机制,靶向抑制miR-378a-3p的表达,促进YY1的表达,而miR-378a-3p靶向抑制YY1的表达,同时LINC00958与miR-378a-3p之间、miR-378a-3p与YY1之间的靶向结合的关系利用双荧光素酶报告基因实验得到证实。miR-378a-3p抑制子宫内膜癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力,同时miR-378a-3p通过抑制MEK/ERK信号通路调控子宫内膜癌的恶性生物学行为。（3）敲低YY1可以逆转过表达LINC00958对子宫内膜癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力的促进作用,这需要借助MEK/ERK信号通路的调控来实现。利用双荧光素酶报告基因实验及CHIP实验,证实了YY1作为转录因子,可以直接与LINC00958启动子区域结合,LINC00958/miR-378a-3p/YY1通过影响MEK/ERK信号通路形成正反馈环路而不是单向轴来调控子宫内膜癌的恶性生物学行为。