去柱头藏红花花部降糖活性提取物的筛选及其制备工艺优化研究

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藏红花作为我国的传统名贵中药材,具有很高的药用价值。藏红花的药用部位仅为花朵雌蕊的三分叉柱头,其占藏红花植株整株的比重很低。在药材生产过程中,大量的摘取了柱头后剩余的花部作为非药用部位被人们所丢弃成为农业废弃物。现代研究发现去柱头藏红花花部含有许多有效成分,具有很大的利用价值。因此本研究聚焦于藏红花生产过程中所产生的直接废弃物——去柱头花部,对其展开基于活性挖掘的可利用基础研究,以获得功效明确、物质基础清晰、制备工艺易产业化的藏红花副产物活性提取物,旨在为资源的深度利用提供理论支撑。主要研究内容如下:首先,对去柱头藏红花花部进行活性部位的筛选。使用有机溶剂按照系统分离法将去柱头藏红花花部分为石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相5个极性部位。为筛选影响葡萄糖消耗的活性部位,将这5个极性部位作用于C2C12肌细胞,检测各部位对肌细胞葡萄糖消耗的影响;为筛选影响脂质含量的活性部位,将这5个极性部位作用于3T3-L1脂肪细胞,检测各部位对脂肪细胞分化和分解的影响。最终筛选出乙酸乙酯相和正丁醇相具有显著促进肌细胞对葡萄糖利用的活性。通过成分分析,发现这两个极性部位富含黄酮类物质。其次,建立符合工业化生产条件的去柱头藏红花花部总黄酮提取纯化方法。基于响应面法(response surface methodology,RSM)确定最佳提取条件,依次为:乙醇浓度67.7%、温度67.6℃、料液比1:30,提取时间3 h以及提取次数2次。采用大孔树脂进行纯化。优选HPD100型大孔树脂,确定最佳上样体积7 BV、上样浓度40 mg/m L、上样流速3 BV/h,最佳洗脱条件为4 BV浓度80%的乙醇。所得纯化后的富集黄酮的去柱头藏红花花部提取物(Enriched flavonoid extract from stigmaless floral residues of Crocus sativus L.,EFRC)中黄酮含量与未纯化前相比提高了5.53倍。对EFRC进行体外和体内水平活性评价。发现EFRC以时间和剂量依赖性方式显著促进C2C12肌细胞对葡萄糖的利用;灌胃给予EFRC可明显降低高脂饲喂诱导的肥胖小鼠异常升高的空腹血糖水平,表明该提取物具有显著的降糖活性。最后,探究EFRC发挥活性的物质基础。对乙酸乙酯相、正丁醇相、未纯化的粗提物和EFRC进行“组效关系”分析。通过UPLC-MS/MS技术获取上述4种提取物中多酚类成分及相对含量数据;并将上述提取物作用于C2C12肌细胞进行葡萄糖消耗评价以获得相对降糖活性。通过灰色关联分析和偏最小二乘回归分析建立上述两者之间的联系,以推测EFRC发挥降糖活性的物质基础。经分析我们推测对EFRC发挥降糖活性贡献最大的潜在成分可能是新北美圣草苷、6’-羟基山奈酚-6,7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芹糖基(1→2)半乳糖苷、山奈酚-3-O-(6’’’-咖啡酰)葡萄糖基-(1→2)-半乳糖苷、异香草醛、槲皮素-3-O-芸香糖苷、6’-羟基山奈酚-3,6-O-二葡萄糖苷、对香豆酸甲酯、3,4-亚甲二氧肉桂醇、山奈酚-3-O-(6’’-乙酰)葡萄糖基-(1→3)-半乳糖苷、1,3-O-二对香豆酰甘油酯。综上,本研究通过活性部位筛选和制备工艺的优化,获得了EFRC,并在体内和体外评价了其活性,同时预测了EFRC的活性物质基础。系统地挖掘了藏红花非药用部位在调节机体糖代谢方面的活性,为资源的深度利用奠定基础,也为相关功能性食品的开发提供思路。
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