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目的观察脂肪细胞游离胆固醇过负荷对成熟的3T3-L1脂肪细胞分泌脂肪因子的影响,并初步探讨其机制。同时观察干预内质网应激对小鼠脂肪因子分泌的影响,并初步探讨其机制。方法一.脂肪细胞内质网应激对3T3-L1细胞脂肪因子分泌的影响及机制体外培养3T3-L1脂肪前体细胞,用鸡尾酒法促分化为成熟脂肪细胞,观察细胞形态的变化,并用油红O染色鉴定脂肪细胞。分别以不同浓度(0-100ug/ml)的氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)和酯酰辅酶A-胆固醇脂酰转移酶(ACAT)抑制剂Sandoz58035(10ug/ml)干预48小时：以ox-LDL(50ug/ml)加ACAT抑制剂(10ug/ml)干预不同时间(0-48小时)；以ox-LDL (50ug/ml)加ACAT抑制剂(10ug/ml)和不同浓度(0-20mM)的4-苯丁酸钠(4-PBA)共同孵育脂肪细胞48小时。用ox-LDL (50ug/ml)加ACAT抑制剂(10ug/ml)处理细胞46小时后再加NF-κB通路的阻断剂PS1145(10μ mol/L)干预2h。Western Blot法检测总蛋白Grp78和CHOP及胞核蛋白NF-κ B的表达；Real-timePCR检测脂肪因子脂联素(adiponectin)、抵抗素(resisitin)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和单核趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA的表达；用ELISA法检测细胞上清液脂肪因子脂联素、抵抗素、TNF-α和MCP-1的表达。二.脂肪细胞内质网应激对小鼠脂肪因子分泌的影响及机制随机将C57BL/6野生型小鼠分为4组(n=40)：高脂饮食喂养加4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)干预组(简称4-PBA干预组)、高脂饮食喂养加共轭牛磺酸熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid, TUDCA)干预组(简称TUDCA干预组)、高脂饮食喂养组(简称高脂饮食组)和标准饮食对照组(简称对照组),每组10只。高脂饮食喂养C57BL/6小鼠8周后,分别予4-PBA20mg·kg-1.d-1, TUDCA0.5g.kg-1.d-1灌胃治疗6周。用HE染色观察小鼠脂肪组织切片形态学变化；用Real-timePCR法半定量测定脂肪组织中脂肪因子脂联素(adiponectin)、抵抗素(resisting肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和单核趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA的表达；同时用ELISA法检测血清脂肪因子脂联素、抵抗素、TNF-α和MCP-1蛋白的分泌；并检测血总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol HDL-C)水平及血糖水平。用western Blot法检测脂肪组织总蛋白Grp78和CHOP的表达及细胞核NF-κB蛋白的表达。结果一.脂肪细胞内质网应激对3T3-L1细胞脂肪因子分泌的影响及机制1.不同浓度的ox-LDL (0-100ug/ml)加ACAT抑制剂处理脂肪细胞48h后,随着ox-LDL浓度的增加,脂肪细胞内游离胆固醇的浓度递增。与对照组(ox-LDL Oug/ml)比较,各干预组细胞内游离胆固醇的浓度均明显增加,差异有显著性(P<0.05)。2.不同浓度的ox-LDL (0-100ug/ml)加ACAT抑制剂干预脂肪细胞48h后,随着ox-LDL浓度的增加,内质网应激标志物GRP78、CHOP蛋白表达显著升高,与对照组(ox-LDL Oug/ml)比较,差异有显著性(P<0.05)；ox-LDL (50ug/ml)和ACAT抑制剂干预脂肪细胞不同时间(0-48h)后,脂肪细胞GRP78、CHOP蛋白表达随干预时间的延长而增加,与对照组(0h)比较,差异有显著性(P<0.05)。3.不同浓度的ox-LDL (0-100ug/ml)加ACAT抑制剂干预脂肪细胞48h后,随着ox-LDL浓度的增加,脂肪细胞的脂联素mRNA表达显著降低,细胞上清液脂联素分泌显著减少(P<0.05)；抵抗素、TNF-α和MCP-1mRNA表达显著及细胞上清液脂联素分泌显著增加(P<0.05)。ox-LDL (50ug/ml)和ACAT抑制剂干预脂肪细胞不同时间(0-48h)后,随干预时间延长,脂肪细胞的脂联素mRNA表达显著降低,细胞上清液脂联素分泌显著减少(P<0.05)；抵抗素、TNF-α和MCP-1mRNA表达及细胞上清液蛋白分泌显著增加(P<0.05),与对照组比较,差异有显著性(P<0.05)。4. ox-LDL (50ug/ml)、ACAT抑制剂和不同浓度(0-20mM)4-PBA干预48小时后,脂肪细胞内质网应激标志物GRP78及CHOP蛋白表达水平降低,脂联素分泌水平升高,抵抗素、TNF-α和MCP-1分泌水平逐渐减少,与对照组(OmM)比较,有统计学差异(P<0.05)。5. ox-LDL (50ug/ml)和ACAT抑制剂干预脂肪细胞46h后,加NF-κB通路的阻断剂PS1145(10μ mol/L)2h后,细胞核NF-κB蛋白表达减少,抵抗素、TNF-α和MCP-1mRNA水平减少,与对照组比较,有统计学差异(P<0.05)。二.内质网应激对小鼠脂肪因子分泌的影响及机制1.高脂饮食喂养8周后,与对照组相比,小鼠体重逐渐增加,小鼠附睾脂肪组织切片显示高脂喂养组的脂肪细胞明显增大；血浆甘油三酯及胆固醇显著的增高(P<0.05)；空腹血糖也显著的升高(P<0.05)；与对照组相比,附睾脂肪组织内质网应激标志物Grp78及CHOP蛋白表达显著升高。2.高脂饮食喂养8周加4-PBA和TUDCA干预6周后,与高脂饲料组相比,4-PBA和TUDCA干预组小鼠体重减轻,小鼠附睾脂肪组织的脂肪细胞体积减小；血浆甘油三酯及胆固醇显著的降低(P<0.05)；空腹血糖也降低,差异有显著性(P<0.05)。3.高脂饮食喂养8周加4-PBA和TUDCA干预6周后,4-PBA和TUDCA干预组小鼠附睾脂肪组织内质网应激标志物GRP-78和CHOP蛋白的表达较高脂饲养组显著降低,差异有显著性(P<0.05)；各组小鼠脂肪组织中脂肪因子脂联素、抵抗素、TNF-α、MCP-1的mRNA无显著差异,但4-PBA和TUDCA干预组小鼠血清中脂联素分泌增加而抵抗素分泌减少(P<0.05),炎症因子TNF-α、MCP-1水平无显著差异。4.肥胖小鼠附睾脂肪组织胞核蛋白NF-κB的表达较对照组相比显著的增强；4-PBA和TUDCA干预肥胖小鼠,胞核蛋白NF-κB的表达较高脂饲料组显著的降低,差异均具有统计学差异(P均<0.05)。结论1.用ox-LDL和ACAT抑制剂干预后可使脂肪细胞内游离胆固醇含量增加。2.胆固醇过负荷可抑制脂肪细胞表达和分泌脂联素,促进抵抗素、TNF-α和MCP-1的表达和分泌,这种影响呈时间依赖性和浓度依赖性。3.胆固醇过负荷使脂肪细胞分泌谱的炎性改变可能与其增强脂肪细胞内质网应激有关。抑制内质网应激可以改善脂肪细胞分泌谱。4. IKK/NF-κB通路可能参与了游离胆固醇诱导产生的脂肪细胞内质网应激时的细胞内信号传导。5.高脂饲养的C57BL/6小鼠导致肥胖,脂肪细胞肥大,糖脂代谢异常。且脂肪组织出现内质网应激增强,脂肪因子的分泌水平均呈炎性改变,即脂联素水平降低,抵抗素、TNF-α、MCP-1分泌增加。6.化学伴侣抑制剂干预肥胖小鼠体内内质网应激可以减轻肥胖小鼠的体重,抑制脂肪细胞肥大,改善糖脂代谢异常,同时改善脂肪分泌的炎性因子谱,即减少肥胖所致脂联素水平的降低,抑制抵抗素的分泌,但对炎症因子TNF-α、MCP-1水平无明显影响。7.肥胖小鼠内质网应激调节脂肪因子分泌谱的变化,可能与IKK/NF-κB炎症通路的激活相关。