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禾谷镰抱菌（Fusarium graminearum）是引起小麦赤霉病的最主要病原菌之一。赤霉病分布广泛,破坏性极强,在世界各个麦区都有发生。它不仅影响小麦的产量,还因病原菌的侵染产生次生代谢产物单端抱霉烯族毒素（以DON为主）,污染小麦的品质。食用病麦或其加工成的食品会引起人畜中毒,严重影响人类的食品安全。随着转基因技术的发展,特别是在农业上的应用,转基因食品不断出现。然而,转基因食品的安全性一直是我们担忧的问题。科学家们注重外源基因本身的安全性,而忽略了外源基因整合到宿主后带来的危害。本文将用能正常产生次生代谢产物DON毒素的禾谷镰孢菌为研究材料,用外源基因即潮霉素磷酸转移酶基因（hph）和Bt毒蛋白基因（CrylAc）定点或随机插入禾谷镰孢菌中,通过检测突变体产DON的能力,评估外源基因插入的风险。防治小麦赤霉病的多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂,已经引起了禾谷镰抱菌的抗药性问题。研究发现,在田间分离得到的抗多菌灵菌株的β 2微管蛋白的167、198位氨基酸发生了点突变,且能提升禾谷镰孢菌产DON的能力。通过高通量测序发现,167位点突变的菌株能引起1036个基因上调,401个基因下调。为探究外源基因的插入对毒素合成的影响,通过潮霉素磷酸转移酶基因（hph）和Bt毒蛋白基因（CrylAc）分别定点插入到禾谷镰孢菌的beta2微管蛋白的167和198位点,分析病菌产DON的能力。结果发现:同一个外源基因插入不同位点或不同外源基因插入同一位点,都引起了 DON毒素的相同倍数的下降,与beta2敲除体产毒一致。同时,突变体的毒素合成基因tri5的表达量也呈下降趋势。由此推测,不同外源基因的定点插入带来的风险可能是一致的。外源基因的随机插入存在一定的不确定性。为研究外源基因随机插入禾谷镰孢菌中对病菌产DON的影响,通过原生质体遗传转化的方法将潮霉素磷酸转移酶基因（hph）和Bt毒蛋白基因（CrylAc）分别转移到禾谷镰孢菌中,各获得1000个随机插入突变体。从以上突变体中各随机选取250个突变体,使用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）定量毒素合成基因tri5的表达。从hph和CrylAc随机插入突变体中分别随机选取2个上调表达和2个下调表达的突变体进行离体毒素和致病力验证,结果与tri5定量表达的结果一致,证明了定量数据的准确性。从定量数据统计的结果发现,hph随机插入突变体tri5基因上调与下调2、5倍以上的比例分别为1:1和1.3:1;CrylAc随机插入突变体tri5基因上调与下调2、5倍以上的比例分别为3.4:1和6.3:1。hph随机插入对tri5的表达的影响分布均匀,而CrylAc随机插入更多的影响tri5的上调表达。根据概率分布直方图也可以看出,CrylAc随机插入突变体的趋势线相对偏右,即CrylAc具有影响tri5上调表达的趋势。因此,不同外源基因的插入对禾谷镰孢菌产DON的影响不同,可能具有一定的偏向性,所以随机插入的方法是具有风险的。以外源基因随机插入影响tri5基因上下调2倍以上的突变体为研究材料,通过Tail-PCR扩增hph和CrylAc的侧翼序列,并与Fusarium graminearum的基因文库进行比对,找到外源基因的插入位点。通过以上方法共找到29个基因,其中10个hph随机插入影响下调表达的基因,7个上调表达的基因,这些基因主要是几丁质合成相关基因、氨基酸合成相关蛋白酶基因、氧化还原酶基因等;6个CrylAc随机插入影响下调表达基因,6个上调表达基因,这些基因包括内吞锚定相关蛋白基因、磷酸果糖激酶基因等。现以CrylAc随机插入引起tri5表达量上调2倍的FGSG01445和下调11倍的FGSG05569为例,用外源基因hph和neo分别定点插入到CrylAc在FGSG01445基因和FGSG05569基因的插入位点。结果表明,三个外源基因的定点插入FGSG01445基因对tri5的表达影响一致,突变体产DON毒素的能力都提高,且不同突变体之间毒素的含量不存在显著性差异（P<0.05）,突变体的致病力增强。三个外源基因定点插入FGSG05569基因对tri5的表达都是下调,突变体产DON毒素的能力都下降,且不同突变体之间毒素的含量不存在显著性差异（P<0.05）,突变头的致病力下降。以上结果进一步证明了hph、neo和CrylAc的定点插入对DON的影响是一致的,不会因为外源基因的不同影响DON,而是与插入的位点有关。