论文部分内容阅读
研究背景:肺癌是全球所有癌症类型中死亡率最高的,其中约40%的患者会出现胸腔积液的临床表现。但是现有的应用于肺癌相关胸腔积液的传统检验确诊方法有较大的局限性,例如检出率低、侵入性强以及对患者机体损伤较大等,而胸水中细胞外囊泡代谢组学检测具有高特异性、创伤性小等优势。在大量的研究结论中都表明了代谢组学用于筛选生物标志物的优势,可将机体一系列生物行为导致的结果进一步放大而易于被捕获。此外,在肺部疾病或肺损伤中,细胞外囊泡直接与病理或受损组织相关,因此可以很好的反映疾病的代谢微环境。本课题组先前的研究表明细胞外囊泡可以作为很好的肿瘤自体靶向药物载体,这也体现出细胞外囊泡对病理组织有较强的特异性。以上这些信息表明,细胞外囊泡可在疾病诊断中作为生物标志物。以往的研究多针对细胞外囊泡中RNA或蛋白质谱进行分析,而对细胞外囊泡中的内容物成分与占比的研究甚少,因此本研究欲通过对胸腔积液中细胞外囊泡进行代谢组学分析来筛选鉴别结核性与恶性胸腔积液的生物标志物。研究方法:（1）严格按照纳入排除标准入组胸水样本,分为发现集和验证集,发现集两组各10例,验证集两组各30例。（2）胸腔积液中细胞外囊泡的分离与验证:取临床患者的胸腔积液30ml,离心去除细胞和碎片后在4℃ 20000xg条件下离心1h,沉淀为lEVs颗粒,上清液经0.22um膜过滤后于4℃ 1 10000xg条件下离心90min,沉淀即为sEVs颗粒;经清洗纯化重悬后置于-80℃保存。细胞外囊泡的鉴定包括:通过透射电子显微镜（TEM）分析EVs的微观形态和大小,纳米粒经跟踪分析仪（NTA）对EVs的粒径分布和浓度分布进行鉴定,免疫印迹（Western blotting）检测EVs蛋白表达（CD9,CD81,CD63,Tsg101,GM130,Calnexin）。（3）分析样品制备和代谢物提取:lEVs,sEVs和胸腔积液样品经5次冻融循环后分别加入300ul甲醇以提高代谢物提取率,随后各加入1ml甲基叔丁基醚,振荡孵育1h充分裂解,释放代谢物,再各加入250ul蒸馏水,旋转1min,于室温平衡15min,后置于12000xg4℃下离心15min,取400ul混合液（上层液200ul,下层液200ul）进行代谢物分析,另取400ul上清液进行脂类分析。（4）LC-MS/MS代谢谱分析:设置ACQUITYBEH C8色谱柱参数以满足不同分析条件,利用50ul乙腈/水（1:4,v/v）重组冻干后的代谢提取物,含5mM醋酸铵的100ul CAN/IPA/H2O（65:30:5,v/v/v）重组冻干脂质提取物,分别取5ul重组样品置于满足各分析要求的LC-MS系统中进行检测。（5）应用代谢组学相关软件从发现集寻找差异代谢物,通过与临床指标进行相关性分析进一步筛选潜在生物标志物,得出最优组合,在验证集验证组合生物标志物的灵敏度、特异性、阳性似然比和阴性似然比。研究结果:（1）受试者临床特征经分析发现与MPE组比较,TPE组血沉（ESR）、C反应蛋白（CRP）、胸水腺苷脱氨酶（pADA）升高,胸水癌胚抗原（pCEA）降低。（2）TEM可见lEVs的大小和形态比sEVs更不均匀,并且大多数lEVs的尺寸（>150nm）大于sEVs的尺寸（50-150nm）。NTA结果表明TPE组和MPE组分别有90.8%和92.1%的sEVs直径在50-200 nm之间。而90%以上的lEVs直径在100-400 nm之间,其大小分布在MPE和TPE之间没有显著差异。lEVs大于sEVs,TPE中平均直径分别为 136.1 nm,224.2 nm,MEP 中平均直径分别为为 136.4 nm,252.3 nm。Western blotting检测两个EVs亚组的膜蛋白CD9、CD63和TSG101。大多数标记物在sEVs中的水平高于在lEVs中的水平。此外,与TPE患者相比,MPE患者的EVs中CD9和TSG101高度富集,本研究中EVs中没有富集Calnexin和GM130（EVs阴性对照）,说明EVs提取较纯。（3）对胸腔积液和EVs中代谢物的分析结果表明,在代谢组学和脂类组学共检测出的579中代谢物中,EVs和胸腔积液的PCA结果聚集的很远,表明sEVs和lEVs的代谢组成和胸腔积液的代谢组成具有显著差异性,而sEVs和lEVs的代谢谱重叠,仅表现出一定的差异性。（4）通过PCA结果的提示,我们分析了 lEVs和sEVs中氨基酸,酰基肉碱和脂类的富集,并比较了它们与胸腔积液中这些物质的差异。结果表明,在TPE-lEVs、TPE-sEVs、MPE-lEVs、MPE-sEVs这四个亚组之间,都各有自己独特的代谢物富集特征,在追踪TPE衍生的EVs亚组和MPE衍生的EVs亚组的生物发生和功能中可能有潜在的价值。（5）进一步以sEVs和lEVs为基准,针对TPE和MPE的差异代谢物进行分析,结果发现lEVs 比 sEVs有更多的代谢物改变,进一步进行代谢物集富集分析以了解EVs差异代谢物的生物学功能,发现主要是与甘氨酸和丝氨酸代谢、亚精胺和精胺的生物合成以及甜菜碱代谢有关。结果表明,TPE和MPE的代谢特征可以通过lEVs和sEVs中的代谢物水平来表示,并且这些差异代谢物可能在胸腔积液的生理学发生机制中起着独特的作用。（6）为了加深对这些代谢产物在MPE和TPE间EVs生理变化的认识,通过相关性分析,探讨了这些差异代谢物与临床指标的关系,探寻其在代谢通路中的关键作用。在sEVs和lEVs中,大多数差异代谢物与pCEA和pADA密切相关。重叠的差异代谢物主要表现为pCEA和pADA之间的负相关关系。此外,pCEA和pADA水平与lEVs中各种氨基酸水平呈显著正相关,在sEVs中相关性不显著。除pCEA和pADA外,lEVs中的差异代谢产物与ESR和CRP之间的关系比sEVs中的更复杂。（7）综合之前的结果,lEVs在TPE和MPE中有许多差异代谢物,且比sEVs更多,并且lEVs与患者的临床指标相关性更显著,因此进一步针对lEVs在TPE和MPE中的差异代谢物进行筛选,以获得候选生物标志物。通过主成分分析,发现TPE的差异代谢物与MPE的差异代谢物有明显分离。通过VIP分析,筛选出了 67个重要变量,在对这67个重要变量进行单因素分析,得到14个代谢物,此后,通过发现集和验证集与AUC曲线分析,确定了四种代谢物作为生物标志物最佳（苯丙氨酸、亮氨酸、磷脂酰胆碱35:0和鞘髓磷脂44:3）,并且在此基础上,这四个代谢物的组合,特异性和灵敏性更高。结论:我们描述了胸腔积液中sEVs和lEVs的代谢物特征。此外,从lEVs和sEVs获得的代谢物图谱彼此之间以及与原始胸腔积液样品之间存在重叠和差异,表明EVs的代谢组学分析具有发现生物标记物的潜力。此外,我们还探索了结核和恶性胸水在lEVs和sEVs水平而不局限于常规胸腔积液水平的代谢重编程,为胸腔积液的机制研究提供了新的见解。最后,我们评估了 EVs代谢物在诊断TPE和MPE方面的潜力。在TPE和MPE的诊断中,特别是对延迟或漏诊的患者,联合lEVs代谢组学和临床指标可能更有效。