【摘 要】
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研究背景与目的结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是最常见的恶性肿瘤之一,严重危害国民健康。寻找并鉴定结直肠癌发展过程中的特征性变化,可为结直肠癌诊治提供新的思路。近年研究表明,结直肠癌发生发展与肠道微生态密切相关。目前多数研究聚焦于具核梭菌、脆弱拟杆菌等“有害菌”对结直肠癌进展的作用及机制,而仅有少量研究报道有关肠道“有益菌”在结直肠癌中的作用。阿克曼菌（Akkermansia
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研究背景与目的结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是最常见的恶性肿瘤之一,严重危害国民健康。寻找并鉴定结直肠癌发展过程中的特征性变化,可为结直肠癌诊治提供新的思路。近年研究表明,结直肠癌发生发展与肠道微生态密切相关。目前多数研究聚焦于具核梭菌、脆弱拟杆菌等“有害菌”对结直肠癌进展的作用及机制,而仅有少量研究报道有关肠道“有益菌”在结直肠癌中的作用。阿克曼菌（Akkermansia muciniphila,Akk）是疣微菌门革兰阴性厌氧菌,有研究报道阿克曼菌可显著抑制结直肠肿瘤的发生,但阿克曼菌通过何种途径抑制结直肠癌发生的分子机制尚未阐明。肠道菌群被认为是结直肠癌宿主微环境的重要组分,深入解析阿克曼菌对结直肠癌肿瘤微环境的作用和机制,有望为菌群-宿主交叉对话提供重要的研究思路。研究内容与方法1.分析GMrepo数据库结直肠癌阿克曼菌丰度,q-PCR检测浙江大学附属邵逸夫医院手术的结直肠癌病人粪便或组织中阿克曼菌丰度;构建Apc Min/+小鼠自发腺瘤模型以及裸鼠皮下成瘤模型,检测阿克曼菌对Apc Min/+小鼠及荷瘤小鼠肿瘤生长能力的影响。2.多色流式细胞术检测Apc Min/+小鼠结肠肿瘤免疫微环境中T细胞系和髓系细胞系的含量;蛋白多因子谱及免疫组织化学法确认巨噬细胞极化情况;体外实验中,流式细胞术检测阿克曼菌对小鼠骨髓来源巨噬细胞（Bone Marrow Derived Macrophages,BMDMs）及小鼠巨噬细胞Raw 264.7极化水平的影响;CCK8检测巨噬细胞对结肠癌细胞增殖能力的影响。3.蛋白印迹检测阿克曼菌对巨噬细胞NLPR3炎症小体的影响;应用NLRP3抑制剂MCC950或应用NLRP3敲除小鼠,流式细胞术、CCK8实验、Apc Min/+模型及皮下成瘤模型体内外探究NLRP3在阿克曼菌引起的巨噬细胞极化及抑癌作用中发挥的作用。4.q-PCR、蛋白印迹检测阿克曼菌对巨噬细胞或肿瘤组织TLR2及NF-κB通路的影响;运用TLR2抑制剂CPT22,蛋白印迹、流式细胞术分析TLR2对NF-κB/NLRP3通路的影响及其在阿克曼菌诱导的巨噬细胞极化中发挥的作用。5.免疫组织化学法及多重免疫荧光法检测不同阿克曼菌丰度结直肠癌患者癌组织中i NOS及CD68+NLRP3+细胞的表达;q-PCR检测癌组织及癌旁组织中NLRP3、TLR2的表达水平以及两者的相关性。研究结果1.阿克曼菌丰度在结直肠癌患者粪便及癌组织中较正常人显著下降;且阿克曼菌可有效抑制Apc Min/+小鼠结直肠肿瘤的发生和皮下荷瘤裸鼠肿瘤的生长。2.Apc Min/+小鼠结直肠肿瘤中,阿克曼菌明显增加M1型巨噬细胞比例,而对其他免疫细胞如M2型巨噬细胞、髓系来源的抑制性细胞、树突状细胞、CD8+T细胞及CD4+T细胞等没有明显作用。进一步发现阿克曼菌可上调肿瘤组织M1型巨噬细胞相关细胞因子,增加i NOS水平。BMDMs与阿克曼菌,或BMDMs与结肠癌细胞共培养,证明阿克曼菌可能通过促进巨噬细胞M1型极化从而抑制结肠癌细胞的增殖。3.细胞及动物模型中,阿克曼菌上调NLRP3、IL-1β前体及其切割体IL-1β（p17）蛋白水平,促进NLRP3炎症小体的激活。体内外抑制或敲除NLRP3可明显削弱阿克曼菌对巨噬细胞的M1型极化及对结肠癌的抑制作用。4.体内外实验中阿克曼菌干预引起模式识别受体TLR2及下游NF-κB通路的激活;抑制BMDMs和Raw264.7细胞中TLR2的表达,可削减阿克曼菌对NF-κB/NLRP3通路的上调作用及阿克曼菌对巨噬细胞的M1型极化作用。5.结直肠癌肿瘤标本中,阿克曼菌丰度与i NOS、巨噬细胞NLRP3的表达具有正向相关性。在结直肠癌病人队列及TCGA数据库中,NLRP3和TLR2水平在结直肠癌患者癌组织中较癌旁组织下降,且两者呈现正相关关系。研究结论1.体内证实阿克曼菌抑制结直肠癌的发生。2.阿克曼菌体内外促进巨噬细胞M1型极化。3.TLR2/NF-κB/NLRP3通路参与阿克曼菌对巨噬细胞的极化过程。
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