目前市场上的抗凝药物主要包括肝素类、香豆素类。肝素类药物自上世纪40年代以来被广泛应用于抗凝和预防血栓形成,其临床应用价值至今仍是任何一种药物都无法代替的。肝素类抗凝药物主要包括普通肝素(heparin, HP),低分子肝素(low molecular weight heparin, LMWH,例如依诺肝素钠),超低分子肝素(ultra low molecular weight heparin, ULMWH),化学合成的肝素类似物。肝素类药物的合理设计(rational design)是基于对肝素类的结构和抗凝功能关系的深入理解而提出的。肝素由于分子量较大,以及在多糖的组成和多糖链的长度上具有多分散性,从而导致了它的出血副作用、皮下注射生物利用度低、药代动力学特征难以预测、用药个体差异大等缺点。现有的LMWH和肝素戊糖则有不能被硫酸鱼精蛋白(protamine sulphate, PS)有效中和的缺点。如果控制肝素组分的高抗凝活性组分的含量和分子链的长度、多分散度(polydispersity,P.D.),则有可能研制出性能更为优越的合理设计的新型低分子肝素(rationally designed low molecular weight heparin,RD-LMWH)即RD-LMWH应具有合适的分子量以保持高抗凝活性,同时具有可以皮下给药的优点；应具有较集中的分子量分布即较小的P.D.,使其药动学特点更好预测；RD-LMWH还应具备可以被PS有效中和的特点。肝素类具有抗Flla活性至少需要18个单糖,即分子量至少为5400Da,而要具有比较小的P.D.,则需要制备得到的RD-LMWH的分子量分布比较窄。实验设计截取5400Da-9000Da之间的组分。依诺肝素钠(enoxaparin sodium)为目前最畅销的LMWH,为碱性β-消除降解法制备的LMWH,且β-消除降解法制备LMWH对样品硫酸根基团破坏小,能较好的保留肝素的高抗凝活性,p-消除降解法的反应所需试剂在终产物中无残留,是一种比较好的LMWH制备方法。实验用p-消除降解法优化后的条件制备得到的LMWH记为β-LMWH;从β-LMWH经Bio Gel P-10分离后截取的分子量在5400Da-9000Da之间的组分,记为RD-LMWH;得到的分子量>9000Da的大分子组分记为LMWH-A;分子量<5400Da的小分子组分记为LMWH-B。用HP及enoxaparin分别作为对照,对RD-LMWH进行结构及理化性质分析,体外活性评价,体内抗血栓活性评价,药代动力学测定。本研究取得的结果和结论有以下几个方面：1. RD-LMWH的制备及分离纯化通过优化碱性p消除降解的成盐、成酯、碱解条件,建立了用p消除法结合凝胶层析法制备符合要求的RD-LMWH的方法,总收率为12.3%。制备的RD-LMWH与HP、enoxaparin用GPC-HPLC方法测得的分子量性质如下RD-LMWH的Mp为6570Da,Mw为6550Da,P.D.(Mw/Mn)为1.052,5400Da～9000Da(%)之间的组分所占比例为76.5%；HP的Mp约为15000Da,Mw约为15000Da,P.D(Mw/Mn)约为1.5；enoxaparin的Mp为2896Da,Mw为4148Da,P.D(Mw/Mn)为1.279。RD-LMWH在分子量上5400Da-9OOODa之间的组分占76.5%,符合实验设计的要求。分子量分布上,制备得到的RD-LMWH P.D.(1.052)接近于1,P.D.低于HP(P.D.约1.5)和enoxaparin (P.D.为1.28),符合实验设计的要求。2. RD-LMWH的结构及理化性质分析通过对样品进行双糖组成分析和核磁共振光谱(1H-NMR),确证了RD-LMWH的主要双糖结构仍为三硫酸双糖。通过紫外光谱、红外光谱、基质辅助激光解吸飞行时间质谱分析,确证了其结构与碱性p-消除降解之前的HP原料及enoxaparin基本相同。应用多角度激光散射测定分子量。RD-LMWH的Mp为6989Da(0.3%),Mw为6751Da(0.4%)；HP的Mp16079Da(0.2%),Mw为16650(0.3%)；enoxaparinMp3735Da(0.2%),Mw为4244Da(0.5%)。测得结果与GPC-HPLC方法基本致。测定了样品的部分理化性质。样品硫酸根含量测定结果：RD-LMWH为27.8%,HP为28.4%,enoxaparin为27.3%,LMWH-A为27.9%,LMWH-B为26.8%,β-LMWH为27.5%。硫酸根/羧酸根比值：RD-LMWH为1.97：1,HP为2.05:1, enoxaparin为1.92：1,LMWH-A为1.95：1,LMWH-B为1.88：1,β-LMWH为1.94：1。RD-LMWH与碱性β-消除降解之前的HP原料及enoxaparin基本一致。比旋度测定结果：RD-LMWH为+50.29°,HP为+50.98°,enoxaparin为+43.63°,LMWH-A为+52.58°,LMWH-A为+52.58°,RD-LMWH为+51.96°,符合肝素类的比旋度质量标准。碱性β-消除降解法制备的LMWH理化性质变化不大。3. RD-LMWH的体外活性评价羊血浆法测定RD-LMWH的抗凝血效价为173.2±0.4IU/mg,HP为204IU/mg, enoxaparin为33.9±0.3IU/mg,LMWH-A为80.1±0.7IU/mg, LMWH-B为23.4±0.12IU/mg,β-LMWH为138.6±0.4IU/mg。生色底物法测定RD-LMWH抗FXa活性为166.5IU/mg, HP为193.2IU/mg, enoxaparin为118.7IU/mg。生色底物法测定RD-LMWH抗FHa效价为159.6IU/mg,HP为190.3IU/mg, enoxaparin为31.9IU/mg。RD-LMWH的抗FXa、抗FHa、抗FXa/FIIa效价的性质都接近HP原料。PS的效价通常以可以中和HP的抗凝血效价计。对PS中和RD-LMWH, HP、enoxaparin的抗FXa效价程度进行了测定。抗FⅩa效价,在PS：样品抗FⅩa效价为1：1时,RD-LMWH的68%可以被中和,HP的抗FⅩa效价96%可以被中和,而enoxaparin只有23%可以被中和。在PS：样品抗FXa效价为3：1时,RD-LMWH的89%可以被中和,HP的抗FⅩa效价可以98%被中和,而enoxaparin只有30%的可以被中和。对PS中和RD-LMWH、HP、enoxaparin的的抗FⅡa效价程度进行了测定。在PS：样品抗FⅡa效价比为1：1时时,RD-LMWH的87%可以被中和,HP的抗FⅡa效价92%可以被中和,而enoxaparin87%可以被中和。在PS：样品抗FⅡa效价比为3：1时,RD-LMWH的97.2%可以被中和,HP的抗FⅡa效价可以97.5%被中和,enoxaparin97.1%可以被中和。PS可以中和抗FⅩa和抗FⅡa效价的程度排序为HP> RD-LMWH>enoxaparin,即RD-LMWH出血情况时,被PS中和的效率高于enoxaparin,因而更安全。4. RD-LMWH的体内抗血栓活性评价采用大鼠体内颈动脉血栓模型,测定了RD-LMWH等对血栓湿重、血浆APTT和血浆PT的影响。实验设生理盐水(saline, SA)组、HP组(3mg/kg)、 enoxaparin组(3mg/kg)、RD-LMWH组(1mg/kg)、RD-LMWH组(3mg/kg). RD-LMWH组(5mg/kg)。结果如下：血栓湿重比较：(1)HP组,enoxaparin组,RD-LMWH组(3mg/kg、5mg/kg)与SA比较,血栓湿重较SA组轻(P<0.05)。RD-LMWH组(1mg/kg)与SA组比较(P>0.05)。(2)所有组与HP相比较,血栓湿重高于HP组(P<0.05)。(3)RD-LMWH样品组与enoxaparin组相比较,RD-LMWH组(1mg/kg)血栓湿重高于enoxaparin组(P<0.05),RD-LMWH组(3mg/kg)血栓湿重低于enoxaparin组(P>0.05),RD-LMWH组(5mg/kg)血栓湿重低于enoxaparin组(P<0.05)。(4)RD-LMWH样品组,对血栓湿重的抑制率,有剂量依赖性。RD-LMWH (1mg/kg)与RD-LMWH(3mg/kg), RD-LMWH(1mg/kg)与RD-LMWH(5mg/kg)差异显著(P<0.05)。APTT比较：(1)与SA组比较,所有组的APTT较SA短(P<0.05)。(2)所有组与HP组相比较, APTT短于HP组(P<0.05)。(3)样品组与enoxaparin组比较,RD-LMWH组(1mg/kg)APTT长于enoxaparin组(P<0.05),RD-LMWH组(3mg/kg、5mg/kg)APTT长于enoxaparin组(P<0.05)。(4)RD-LMWH样品组,对APTT的延长作用有剂量依赖性,剂量越高,延长作用越明显。RD-LMWH组(1mg/kg.3mg/kg.5mg/kg)相互之间差异显著(P<0.05)。PT比较：(1)HP组,enoxaparin组,RD-LMWH(1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg)分别与SA比较,PT较SA短,差异显著(P<0.05)。(2)所有组与HP组比较,PT短于HP组(P<0.05)。3)RD-LMWH样品组与enoxaparin组比较,RD-LMWH组(1mg/kg)PT长于enoxaparin组(P>0.05),RD-LMWH组(3mg/kg、5mg/kg)PT长于enoxaparin组(P<0.05)。(4) RD-LMWH样品组,对PT的延长作用有剂量依赖性,RD-LMWH组(1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg)相互之间差异显著(P<0.05)。采用大鼠体内下腔静脉血栓模型,测定了RD-LMWH等血栓湿重、该模型大鼠APTT和PT的影响。实验设SA组、HP组(3mg/kg)、enoxaparin组3mg/kg)、 RD-LMWH组(1mg/kg)、RD-LMWH组(3mg/kg)、RD-LMWH组(5mg/kg)。结果如下：血栓湿重：(1)与SA组比较,HP组,enoxaparin组,RD-LMWH组(1mg/kg,3mg/kg,5mg/kg)与SA比较,血栓湿重较SA轻(P<0.05)。(2)RD-LMWH所有组与HP相比较,血栓湿重高于HP组(P<0.05)。(3)RD-LMWH样品组与enoxaparin组相比较,RD-LMWH组(1mg/kg)血栓湿重高于enoxaparin(P>0.05), RD-LMWH组(3mg/kg)血栓湿重低于enoxaparin组(P>0.05), RD-LMWH组(5mg/kg)血栓湿重低于enoxaparin组(P<0.05)。(4)RD-LMWH样品组对血栓湿重的抑制率,有剂量依赖性。样品之间两两比较,RD-LMWH (1mg/kg)与RD-LMWH (3mg/kg), RD-LMWH (1mg/kg)与RD-LMWH (5mg/kg)差异显著(P<0.05)。Wessler评分比较：(1)与SA比较,HP组,enoxaparin组,RD-LMWH(1mg/kg), RD-LMWH(3mg/kg), RD-LMWH(5mg/kg)与SA比较,Wessler评分较SA组低(P<0.05)。(2)所有组与HP组相比较,wessler评分高于HP组(P<0.05)。(3)RD-LMWH样品组与enoxaparin组相比较,RD-LMWH组(1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg)的wessler评分低于enoxaparin组(P>0.05)。(4)RD-LMWH样品组对wessler评分的影响,有剂量依赖性,剂量越高,评分越低。RD-LMWH(1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg)的wessler评分相互之间差异不显著(P>0.05)。APTT比较：(1)与SA组比较,HP组,RD-PLMWH组(1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg)(?)匕SA组APTT长(P<0.05)；enoxaparin组比SA组APTT长(P>0.05)。(2)所有组与HP相比较,APTT短于HP组(P<0.05)。(3)RD-LMWH样品组与enoxaparin组比较,RD-LMWH组(1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg)的APTT长于enoxaparin组(P<0.05)。(4)RD-LMWH样品组,对APTT的延长作用有剂量依赖性,剂量越大,延长作用越明显。RD-LMWH组(1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg) APTT相互之间差异显著(P<0.05)。PT比较：(1)与SA组比较,HP,RD-LMWH(3mg/kg,5mg/kg)(?)匕SA组PT长(P<0.05)；enoxaparin,RD-LMWH(1mg/kg)(?)匕SA组PT长(P>0.05)。(2)所有组与HP组相比较,PT短于HP组(P<0.05)。(3)RD-LMWH样品组与enoxaparin组比较,RD-LMWH(lmg/kg) PT长于enoxaparin组(P>0.05),RD-LMWH(3mg/kg,5mg/kg)PT显著长于enoxaparin组(P<0.05)。(4)样品组,对PT的延长作用有剂量依赖性,剂量越大,延长作用越明显。RD-LMWH(1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg)的PT相互之间差异显著(P<0.05)。5. RD-LMWH的药代动力学研究用新西兰兔进行了体内药动学测定。RD-LMWH和enoxaparin采用皮下给药,HP为静脉给药,给药量均为3mg/kg。以抗FXa活性为检测指标,用DAS2.0药动学软件进行计算,得到以下结果：RD-LMWH t1/2为3.1±0.788h,AUC(0-t)(IU/L*h)为4.1±0.474,Tmax为3.667±0.816h, Cmax为0.49±0.047(IU/mL)；HP的t1/2为0.606±0.187h,AUC(0-t)为6.343±1.467(IU/L*h),Tmax为0.167h,Cmax为5.29±0.638(IU/mL); enoxaparint1/2为3.971±1.029h,AUC(0-t)为3.675±0.37(IU/L*h),Tmax为2.667±1.033h,Cmax为0.397±0.029(IU/mL)。实验同时测定了不同样品在不同时间点的兔血浆APTT、PT。表明Tmax:RD-LMWH>enoxaparin>HP, RD-LMWH由于分子量较大,达峰时间较enoxaparin长,HP为静脉给药血药浓度达峰时间最短。t1/2:enoxaparin> RD-LMWH>HP。由AUC(0-t)和Cmax可以看出RD-LMWH可以达到治疗所需的血药浓度,达到最初的设计的目的。6.课题总结及创新性(1)建立了碱性p-消除降解法结合凝胶层析法制备合理设计的RD-LMWH的方法。(2)对所制备的RD-LMWH进行了结构分析和理化性质分析,并设HP、enoxaparin为对照,表明所得RD-LMWH守合设计要求。(3)对所制备的RD-LMWH进行了抗凝活性、抗FXa活性和抗FⅡa活性测定,并设HP、enoxaparin为对照。结果表明RD-LMWH的抗FXa和抗FⅡa活性均较高,RD-LMWH的抗FXa：抗FⅡa活性约为1：1,HP抗FXa：抗FⅡa活性约为1：1,enoxaparin抗FXa：抗FⅡa活性约为3.5：1,可见RD-LMWH在抗凝活性方面的性质较接近于HP。测定了RD-LMWH被PS中和程度,同时以HP和enoxaparin为对照,结果表明RD-LMWH的抗FXa和抗FⅡa被PS中和的程度更接近于HP,优于enoxapanno(4)对所制备的RD-LMWH通过血栓湿重、APTT、PT等为检测指标,对其抗动脉血栓和抗静脉血栓的效果进行了评价,并设HP、enoxarin为对照。结果表明RD-LMWH可以起到有效的抗动脉血栓和抗静脉血栓作用。(5)对所制备的RD-LMWH进行了进行了兔体内的药动学评价,结果表明RD-LMWH给药后的t1/2和AUC(0-t)等方面的性质接近于enoxapann,皮下注射给药可以达到治疗效果的血药浓度。