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随着恶性肿瘤对人类的威胁越来越大,寻找一种新的、能有效治疗癌症的方法已成为癌症相关工作者的主要任务之一。肿瘤的靶向基因-病毒疗法结合了基因治疗和病毒疗法的优势,利用病毒为载体,将目的基因整合到病毒载体上,从而达到有效杀死肿瘤细胞的目的,为肿瘤治愈带来了新的希望。腺病毒作为病毒疗法中的首选病毒,不仅安全、宿主范围广、稳定性好、而且不易突变,容易获得较高的滴度。为了增强腺病毒对肿瘤细胞的杀伤作用,我们选择了EquinatoxinⅡ(EqtⅡ)作为肿瘤治疗基因插入到腺病毒载体上。EqtⅡ是一种海葵溶细胞素,作为水溶性的蛋白,通过静电引力和疏水作用与脂膜发生相互作用,海葵溶细胞素首先通过正电荷与磷脂双分子层表面的负电荷结合,紧接着112-116位色氨酸丰富区和膜发生初步结合,最后海葵溶细胞素的N端双亲性螺旋区插入膜内,形成三聚体或四聚体以形成阳离子通道,且此过程为不可逆过程。此外,在之前的报道中提到,EqtⅡ不仅具有较强的溶血作用,而且也能够有效抑制肿瘤细胞增殖。在本论文的研究中,我们利用Adeasy腺病毒包装系统,将外源基因EqtⅡ插入到重组腺病毒载体中,构建出非复制型病毒Ad-EqtⅡ和复制型病毒SD55-EqtⅡ。利用Western Blot检测目的蛋白,目的病毒能够在肿瘤细胞中正常复制和表达。利用MTT比色法检测目的病毒对肿瘤细胞的杀伤作用以及对正常肝细胞L02的安全性,目的病毒不仅表出了良好的抗肿瘤活性,而且对肝癌细胞的毒性较正常肝细胞大。结晶紫染色结果表明目的病毒具有良好的抗肿瘤活性。Hoechst33342初步说明目的病毒诱导细胞死亡途径与凋亡无关。天然抗肿瘤药物具有低毒、活性高、来源广等诸多优点,使其抗肿瘤活性研究已经成为了天然产物的研究热点。苯并二氢吡喃环是二氢吡喃中主要发挥活性的结构部分,为了提高该类天然产物的抗肿瘤活性,以天然吡喃类化合物为母版进行结构修饰与合成,以期获得抗肿瘤活性更好,毒副作用小的衍生物。PI3K/Akt信号通路具有承载着多方面的功能,例如抑制细胞凋亡,促进细胞生长,促进血管生成,是细胞生存的重要通路之一。而Akt基因是PI3K/Akt通路的核心,研究表明,Akt在多种肿瘤细胞中存在着过度表达以及活化的现象,Akt已被定义为癌基因,Akt基因的深入研究有可能为研究开发出新的抗肿瘤药物以及方法提供一定的理论依据。本课题在前期的研究基础上,开展药物作用的信号通路与PI3K/Akt信号传导通路之间的关系,寻找潜在的药物靶分子,为研发新型二氢吡喃类抗肿瘤药物提供理论依据。通过对天然吡喃酮的结构修饰与合成,我们获得了36种衍生物,通过对其活性的初步筛选,我们决定围绕化合物Li Q-1进行对天然吡喃酮的结构修饰及其抗肿瘤活性研究。MTT法检测化合物对细胞的抑制作用,结果显示药物对A549、SMMC-7721、SGC-7901、K562、K562/Akt、MCF-7的IC50分别为30.08、55.28、57.45、34.28、39.26和64.97μM,表明化合物对癌细胞均具备了较强的杀伤能力,并通过生长曲线的绘制发现化合物对药物的作用呈计量依赖关系。Hoechst33342染色结果观察到经化合物处理后的细胞出现核固缩、凋亡小体等明显的凋亡现象。再利用Western Blot法检测化合物处理肺癌细胞株A549,48小时后,细胞内的caspase3、9和PARP这三种蛋白的表达量水平,发现其相比于对照均有明显的下降,说明化合物通过凋亡途径诱导细胞死亡。最后通过Q-PCR检测化合物作用人红白血病细胞K562之后,细胞内Akt基因的表达水平,结果显示实验组与对照组相比,Akt基因的表达水平略有下降,而Akt基因往往在癌细胞内是过分活跃的,表明化合物也有可能通过对Akt基因的抑制来诱导细胞凋亡,这与本文最初的猜测想符合,Akt有可能成为新的药物靶标分子,为研制开发出新的抗肿瘤药物提供理论依据。