肠出血性大肠杆菌的主要致病菌株为O157:H7,同时也是与公共卫生有关的最重要的出血性大肠杆菌的血清类型。大肠杆菌0157:H7在感染宿主后,主要可引发感染性腹泻、出血性结肠炎、血栓性血小板减少性紫癜、肾溶血性尿毒综合征等严重并发症,严重者可导致死亡。与大肠杆菌0157:H7一样作为四大食源性致病菌之一的单增李斯特菌,在感染宿主后主要表现为胃肠炎、脑膜炎、败血症、神经系统损伤、流产和单核细胞增多等。本研究通过对大肠杆菌0157:H7和单增李斯特菌的毒力因子的研究,建立了多个实时荧光定量PCR反应体系,并将其初步应用到实际检测中,为进一步研究和监控这两种菌奠定基础。试验分为以下四个部分:试验Ⅰ 大肠杆菌0157:H7多重荧光定量PCR检测方法的建立根据GenBank公布的大肠杆菌0157:H7的菌体抗原rfbE基因、鞭毛抗原fliC基因、溶血素hlyA基因、紧密粘附素eaeA基因和志贺毒素1、2基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列用软件Primer Express 5.0分别设计6对特异性的引物及相应的 Taqman探针,rfbE/eaeA、Stx1/hlyA、fliC/Stx2 探针 5’端分别标记为 FAM、HEX、CY5荧光报告基团,3’端都标记为BHQ1荧光淬灭基团。通过优化反应体系和程序,得到优化的三个测试属性(检测时间、特异性和灵敏度),建立2个能够快速、特异性地检测大肠杆菌O157:H7及其4个主要毒力基因的三重荧光定量PCR。结果显示:该方法灵敏度高,目的基因Stx1、rfbE、fliC、eaeA、hlyA、Stx2片段长度分别为108 bp、87 bp、86 bp、125 bp、141 bp、118 bp,重组质粒最低检测限分别约为20、30、20、20、30、40拷贝数/μL;特异性试验证明该菌与其他菌种无交叉反应;具有较好的重复性,变异系数均小于2%;检测过程耗时约1h。以上结果表明本研究所建立的三重荧光定量PCR方法的敏感性、重复性及特异性均较好,可作为同时快速检测肠出血性大肠杆菌0157:H7及其毒力基因的方法。试验Ⅱ 单增李斯特菌单项荧光定量PCR检测方法的建立根据GenBank公布的单增李斯特菌的毒力基因hlyA序列,选择保守序列设计一对特异性引物及相应的Taqman探针,探针5’端标记为FAM荧光报告基团,3’端标记BHQ1荧光淬灭基团。构建阳性重组质粒hlyA进行荧光定量PCR检测,通过优化反应体系和程序建立单项荧光定量PCR方法,分析其灵敏度。结果显示:该方法灵敏度高,最低检测限为70拷贝数/μL;特异性试验证明该菌与其他菌种无交叉反应;具有较好的重复性,变异系数均小于2%;检测过程耗时约1 h。该法对阳性重组质粒hlyA定量扩增所建立标准曲线的相关系数为0.998。以上结果表明该方法特异性强、敏感性高,可为肉和肉制品中快速、准确的定量检测李斯特菌奠定基础。试验Ⅲ 大肠杆菌0157:H7和单增李斯特菌多重荧光定量PCR检测方法的建立根据单增李斯特菌的hlyA基因与大肠杆菌0157:H7的rfbE、Stx1、fliC、Stx2、eaeA、hlyA基因设计的引物和对应的TaqMan探针,以两种菌的重组质粒为模板,建立大肠杆菌0157:H7和单增李斯特菌这两种菌的多重实时荧光定量PCR检测方法。结果显示:当选择的通道不同时,通过荧光定量PCR检测,两种菌的特异性基因能够在同一反应体系中检测到,说明本试验成功建立了同时检测大肠杆菌0157:H7和单增李斯特菌的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。试验Ⅳ 大肠杆菌0157:H7和单增李斯特菌人工污染猪肉样品的检测根据本研究中大肠杆菌0157:H7和单增李斯特菌设计的引物和对应的TaqMan探针,以及建立的大肠杆菌0157:H7多重实时荧光定量PCR和单增李斯特菌单项实时荧光定量PCR检测方法,将这些检测方法应用到人工染菌模拟猪肉样品的检测中。结果显示:无需富集或富集8 h后测得大肠杆菌0157:H7的最低检出限分别为200 CFU/mL与1 CFU/mL,而单增李斯特菌分别为200 CFU/mL与5 CFU/mL。